PCR技術邁入第三代微滴式數字PCR

　　你說世界變化快不快，PCR已經邁入第三代!近日，一種稱為微滴式數字PCR(ddPCR?)的新技術出現在《Analytical Chemistry》雜志上，它能夠確定樣品中待測靶分子的絕對數目。

　　第一代PCR就是我們目前最常用的終點PCR技術，通過凝膠電泳獲得定性的結果。風靡全球的實時定量PCR技術為第二代，它利用熒光試劑監控擴增，來實現相對定量。在開展基因表達分析時，需要標準曲線或參考基因來協助定量。

　　微滴式數字PCR則為第三代PCR，它不再依賴Cq值或內參基因，即可確定低至單拷貝的待檢靶分子的絕對數目。微滴技術讓數字PCR更低成本，且更實用。

　　文章的第一作者為Bio-Rad公司的Ben Hindson博士。Bio-Rad公司在不久前推出了QX100? 微滴式數字PCR系統，帶來了ddPCR技術。此系統能夠確定核酸分子的絕對數目，讓研究人員無比精確地研究生物學。Hindson博士表示，ddPCR 克服了之前數字PCR系統的缺陷，如成本高、通量有限且流程復雜。

　　QX100 微滴式數字PCR系統在傳統的PCR擴增前對樣品進行微滴化處理，即將含有核酸分子的反應體系分成成千上萬個納升級的微滴，其中每個微滴或不含待檢核酸靶分子，或者含有一個至數個待檢核酸靶分子。經PCR擴增后，逐個對每個微滴進行檢測，有熒光信號的微滴判讀為1，沒有熒光信號的微滴判讀為0，根據泊松分布原理及陽性微滴的個數與比例即可得出靶分子的起始拷貝數或濃度。

　　這篇新發表的文章證明了QX100微滴式數字PCR系統在三個方面的作用：拷貝數變異(CNV)研究、稀有等位基因檢測和血漿DNA定量。

　　對于CNV研究，大量的微滴提供了足夠的精確度，能準確測定拷貝數狀態。利用QX100微滴式數字PCR系統來篩查HapMap樣品的CNV，拷貝數狀態可完全分辨。

　　對于稀有等位基因的檢測，將突變DNA與高度同源的野生型DNA分開，提高了靈敏度。有了QX100系統，研究人員能夠檢測BRAF V600E中低至0.001%的突變片段，與定量PCR相比，靈敏度提高1000倍。

　　最后，研究人員還利用微滴式數字PCR技術準確檢測了孕婦血漿中高度片段化的DNA。這種方法有望發展成無創的產前診斷技術，因此現在也很熱門。

　　作者認為，此系統能夠協助研究人員探索復雜的遺傳圖像，發現并驗證新的疾病關聯，并定義分子診斷的新時代。