一般PCR方法在擴增大片段DNA時的局限性：
通常所用的PCR方法都在兩個方面有局限，即目標產物精確程度和合成片段的大小。Pfu(Pyrococcus furiosus)DNA聚合酶，具有完整的3'外切酶校讀活性（3'-editing-exonuclease），可以將每個循環中堿基的錯配率由10*-4降到10*-3，從而提高PCR產物的準確性。但它在擴增1.5-2.0kb片段時，效率比Klentaq l(Taq DNA聚酶N-末端缺失突變體，類似于E.coli DNA聚合酶Ｉ Klenow片段）或AmpliTaq（全長的Taq DNA聚合酶）等聚合酶差；在擴增5.0-7.0kb片段時亦不比各種形式的Taq DNA聚合酶（如Ampli Taq、Klentaq 1、Klentaq 5等N-末端缺失的變異株）有明顯優越之處。因而以往的PCR反應產物限制在5.0kb以內。超出這一范圍，PCR擴增反應效率將明顯下降，同時產物會降解。即使將延伸時間定為30分鐘（10倍于通常所需）亦無改進。
利用兩種DNA聚合酶進行較大片段DNA的擴增
美國華盛頓大學醫學院的Barnes WM等對前述問題進行了深入系統的研究，認為：PCR反應效率低最主要的原因是由于錯配的堿基阻礙了延伸反應的正常進行，Pfu DNA聚合酶雖然可以通過“校讀”功能糾正錯配的堿基，但亦可能降解引物，尤其是在較長反應時間下；酶濃度較高時，反應效果更差。因此必需將Pfu DNA聚合酶的濃度控制在較低狀態，同時配合使用Klentaq l等DNA聚合酶，這樣既可以有效地去除錯配，又可以使Klentaq l等催化的延伸反應順暢進行。實驗證實，按15:1 的比例混合使用Klentaq l和Pfu DNA聚合酶，引物大小為27-33nt,即可使反應有效進行。當然，對于各種不同條件的反應，兩種類型酶的最佳配比需要具體考慮。
控制脫嘌呤反應增強擴增效率
在PCR反應體系中某些成分耐熱性較差，會影響反應效率。DNA聚合酶的熱穩定性一般都是較好的，可能是模板DNA在溫度較高的環境中某些位點發生脫嘌呤反應從而阻礙反應的順利進行。Lindahl和Nyberg的研究結果顯示：在70℃ pH7.4的條件下， 單鏈DNA脫嘌 呤反應的速度是雙鏈DNA的４倍；100℃ pH7.0時，100kb的堿基中每分鐘將有１個位點脫嘌呤。這一反應與緩沖體系中酸堿度的變化有關。人們注意到：三羥甲基氨基甲烷（Tris）的酸解離常數（pKa）會隨溫度升高而改變，平均每升高１℃，pKa值降低0.03。因而，在25℃時pH8.55的PCR反應體系，到95℃熱變性時，pH值將變為6.45，這就很可能誘導脫嘌呤反應。 為了解決這一問題，可以采取下列措施：
縮短熱變性時間，Barnes等在擴增35kb的大片段時，變性條件為95℃5秒，取得滿意結果；
盡可能使升溫、 降溫過程縮短，可選擇使用導熱性能優越的薄壁反應管及較為先進的擴增設備；
適當提高反應體系的pH值，反應最初應控制在pH8.8-9.2范圍；
適當增加延伸時間（可長至20分鐘）。使用這種方法可以擴增最大為35kb的DNA片段，產物的準確性亦有充分保證，克服了以往基因克隆過程中出現的DNA分子內的堿基重排和可能的毒性危險等問題。