由于糞便中含有大量Taq 聚合酶的抑制物質, 很多方法提取的DNA 其擴增效果不佳, 如H?0?8ss 在PCR 反應中就加了牛血清蛋白來克服抑制劑對Taq 聚合酶的抑制作用。目前采取的方法有多種, 作者將其大致分兩類:
( 1 ) 糞便裂解后純化DNA , 如Ernest et al .(2000) 在糞便經蛋白酶K處理后, 用酚- 氯仿多次抽提, 然后, DNA 溶液經聚丙烯酰胺葡聚糖柱子洗脫來純化DNA ; Taberlet et al . (1996) 、Reedet al . (1997) 和Parsons et al . (1999) 用硫氰酸胍處理糞便, 直接用硅粒沉淀DNA 而使之與雜質分離達到純化的目的; Constable et al . (1995) 和Savill et al . (2001) 在用蛋白酶K 裂解糞便的同時另外加入了十六烷基三甲基溴化銨( Cetylt rimethyl2ammoniumbromide , CTAB) 消化PCR 反應抑制物, 再經多次酚- 氯仿抽提純化DNA ; Ding et al . (1998) 將DNA 抽提試劑盒
(XTRAXTM DNA Ext raction Kit , BIODESIGN International) 應用于大熊貓的糞便DNA 提取, Tengel et al . (2001) 介紹了提取糞便DNA 的試劑盒QIAamp DNA Stool Mini Kit , Germany) 清除PCR 抑制物; Reed et al . (1997) 將堿性多價金屬離子螯合樹脂Chelex2100 應用于清除抑制物(Reed 在自己的文章中已證明該方法并非理想) 。這些方法或操作繁瑣, 花費高, 或結果不十分理想, 或缺乏實驗室通用性。
(2) 糞便預處理, 如Deuter et al . (1995) 先將糞便于- 80 ℃冷凍, 再勻漿, 經兩次差速離心除去了殘渣, 但經過柱洗脫才得到了純度高的DNA ; Lantz et al . (1997) 利用聚乙二醇和葡聚糖40 組成的二相系統對糞便進行預處理, 很理想地除去了PCR 抑制物, 但花費較高, 缺乏通用性; Machiels et al . (2000) 用磷酸緩沖鹽溶液和酚- 氯仿- 異戊醇組成的二相系統對糞便預處理, 但其后的處理過程十分繁瑣。
介紹一種在細胞裂解前經丙酮預處理的抽提方法。丙酮是一種優良的有機溶劑, 在DNA 的提取過程中曾被用來消除抑制物, 有很好的效果(Schneiderbauer et al . , 1991 ; Udy et al . , 1994 ;施蘇華等, 1996 ; Purohit et al . , 2003) 。本實驗
預處理中丙酮能很好地將糞便中的色素、多糖及一些有機鹽等PCR 抑制物除去, 最后得到的DNA 可用于PCR 擴增, 并用于進一步的遺傳分析。
一種從大熊貓糞便中提取DNA 的改進方法鐘 華① 賴旭龍② 魏榮平③ 劉中來①33
( ①華中師范大學生命科學學院, 武漢430079)
( ②中國地質大學地球科學學院, 武漢430074) ( ③中國保護大熊貓研究中心, 四川臥龍623006)
。在糞便DNA的提取過程中采用一個新的預處理方法, 將糞便用預冷的丙酮洗2～3 次, 除去糞便中含有的大量PCR 抑制物,然后用蛋白酶K裂解、酚- 氯仿抽提, 能提取到純度很高的DNA 供PCR 擴增。
糞便DNA小量提取試劑盒
動物糞便樣品中存在大量有意義的基因組DNA，其DNA主要來自于動物自身脫落的消化道細胞、消化道中各種細菌(如大腸桿菌)或真菌等微生物,以及一些末消化食物DNA。由于糞便中存在大量抑制因子，所以常規的DNA純化方式并不能有效地去除這些雜質，而導致下游實驗的失敗，如PCR不能擴增出所需片段。Omega Biotek
公司采用了硅膠柱純化方式和獨特的溶液系統,能有效去除動物糞便中各種影響下游實驗（如PCR）的抑制因子，并能高效地回收糞便中的基因組DNA。
動物糞便樣品經PBS和ST1重懸后，70°C處理5分鐘裂解細菌；離心去除不溶解的雜質，加入ST2和蛋白酶消化樣品；氯仿抽提去除蛋白質，轉移上清液加入異丙醇沉淀DNA，進一步去除各種雜質；加入滅菌水溶解DNA，調節結合條件，上柱離心吸附DNA；經過兩次快速洗滌，去除殘留的雜質和抑制物，最后DNA溶解于滅菌水或低鹽緩沖液中。純化的DNA可直接用于PCR,Southern雜交，定量PCR等各種靈敏實驗。