PCR檢測方法（二）

3.實驗操作注意事項：盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進行擴增反應是謹慎認真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環節都應該注意：

（1）戴一次性手套，若不小心濺上反應液，立即更換手套。

（2）使用一次性吸頭，嚴禁與PCR產物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染。

（3）避免反應液飛濺，打開反應管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面。

（4）操作多份樣品時，制備反應混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應的精確度。

（5）最后加入反應模板，加入后蓋緊反應管。

（6）操作時設立陰陽性對照和空白對照，即可驗證PCR反應的可靠性，又可以協助判斷擴增系統的可信性。

（7）盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產物氣溶膠或標本DNA的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應該專用，不能交叉使用，尤其是PCR產物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區。

（8）重復實驗，驗證結果，慎下結論。

二、追蹤污染源

如果不慎發生污染情況，應從下面幾條出發，逐一分析，排除污染。

1.設立陰陽性對照：有利于監測反應體系各成分的污染情況。選擇陽性對照時，應選擇擴增弱，且重復性好的樣品，因強陽性對照可產生大量不必要的擴增序列，反而可能成為潛在的污染源。如果以含靶序列的重組質粒為對照，100個拷貝之內的靶序列就足以產生陽性擴增。陰性對照的選擇亦要慎重，因為PCR敏感性極高，可以從其它方法（Sourthern印跡或點雜交等）檢測陰性的標本中檢測出極微量的靶分子。此外，每次擴增均應包括PCR體系中各試劑的時機對照，即包括PCR反應所需的全部成分，而不加模板DNA,這對監測試劑中PCR產物殘留污染是非常有益的。如果擴增結果中試劑對照為陽性結果，就是某一種或數種試劑被污染了。此時，要全部更換一批新的試劑進行擴增，擴增時設立不同的反應管，每一管含有一種被檢測試劑，在檢出污染試劑后，應馬上處理。

2.環境污染：在排除試劑污染的可能性外，更換試劑后，若不久又發現試劑被污染了，如果預防措施比較嚴密，則考慮可能為環境污染。環境污染中常見的污染源主要有：

（1）模板提取時真空抽干裝置。

（2）凝膠電泳加樣器。

（3）電泳裝置。

（4）紫外分析儀。

（5）切膠用刀或手術刀片。

（6）離心機。

（7）冰箱門把手，冷凍架，門把手或實驗臺面等。此時可用擦拭實驗來查找可疑污染源：

（a）用無菌水浸泡過的滅菌棉簽擦拭可疑污染源。（b）0.1ml去離子水浸泡。（c）取5ml做PCR實驗。（d）電泳檢測結果。

（8）氣溶膠。

如果經過上述追蹤實驗，仍不能查找到確切污染源，則污染可能是由空氣中PCR產物的氣溶膠造成的，此時就應該更換實驗場所，若條件不允許，則重新設計新的引物（與原引物無相關性）。

三、污染處理

1.環境污染

（1）稀酸處理法：對可疑器具用1mol/L鹽酸擦拭或浸泡，使殘余DNA脫嘌呤。

（2）紫外照射（UV）法：紫外波長（nm）一般選擇254/300nm,照射30min即可。需要注意的是，選擇UV作為消除殘留PCR產物污染時，要考慮PCR產物的長度與產物序列中堿基的分布，UV照射僅對500bp以上長片段有效，對短片段效果不大。UV照射時，PCR產物中嘧啶堿基會形成二聚體，這些二聚體可使延伸終止，但并不是DNA鏈中所有嘧啶均能形成二聚體，且UV照射還可使二聚體斷裂。形成二聚體的程度取決于UV波長，嘧啶二聚體的類型及與二聚體位點相鄰核苷酸的序列。在受照射的長DNA鏈上，形成二聚體缺陷的數量少于0.065/堿基，其他非二聚體的光照損傷（如環丁烷型嘧啶復合體，胸腺嘧啶乙二醇，DNA鏈間與鏈內的交聯和DNA斷裂等）均可終止TaqDNA聚合酶的延伸。這些位點的數量與二聚體位點相當。如果這些位點（0.13/堿基）在DNA分子上隨機分布，一個500bp片段的DNA分子鏈上將有32處損傷位點，那么，105個這樣的分子中每個分子中會至少有一處損傷。相反，如果100bp的片段，每條鏈上僅有6處損傷，105個拷貝分子中將有許多分子沒有任何損傷。這就是UV照射有一定的片段長度限制的原因。

2.反應液污染

可采用下列方法之一處理：

（1）DNaseI法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5UDNaseI,室溫反應30min后加熱滅活，然后加入模板和Taq聚合酶進行正常PCR擴增。該方法的優點是不需要知道污染DNA的序列。

（2）內切酶法：選擇識別4個堿基的內切酶（如MspI和TaqI等），可同時選擇幾種，以克服用一種酶只能識別特定序列的缺陷，室溫作用1h后加熱滅活進行PCR。

（3）紫外照射法：未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液進行紫外照射，注意事項與方法同上述UV照射法。

（4）g射線輻射法：1.5kGy的輻射可完全破壞0.1ng基因組DNA,2.0kGy可破壞104拷貝的質粒分子，4.0kGy仍不影響PCR,但高于此限度會使PCR擴增效率下降。引物可受照射而不影響PCR,g射線是通過水的離子化產生自由基來破壞DNA的。

3.尿嘧啶糖苷酶（UNG）法

由于UV照射的去污染作用對500bp以下的片段效果不好，而臨床用于檢測的PCR擴增片段通常為300bp左右，因此UNG的預防作用日益受到重視和肯定。

（1）原理：在PCR產物或引物中用dU代替dT.這種dU化的PCR產物與UNG一起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架間的N-糖基鍵，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，從而失去被再擴增的能力。UNG對不含dU的模板無任何影響。UNG可從單或雙鏈DNA中消除尿嘧啶，而對RNA中的尿嘧啶和單一尿嘧啶分子則無任何作用。

（2）dUTP法：用dUTP代替dTTP,使產物中摻入大量dU.在再次進行PCR擴增前，用UNG處理PCR混合液即可消除PCR產物的殘留污染。由于UNG在PCR循環中的變性一步便可被滅活，因此不會影響含dU的新的PCR產物。

（3）dU引物法：合成引物時以dU代dT,這樣PCR產物中僅5ˊ端帶dU.UNG處理后，引物失去了結合位點而不能擴增。對長片段（1-2kb以上）的擴增用dUTP法效率較用dTTP低，而用dU法就可克服這一缺點。dU引物最好將dU設計在3ˊ端或近ˊ端。該法僅能用于引物以外試劑的處理。

（4）優點：可以去除任何來源的污染；UNG處理可以和PCR擴增在同一個反應管內進行；由于擴增產物中有大量dU存在，可徹底消除污染源。

（5）需注意的是摻入dUTP的DNA不應對產物的任何操作有影響，在進行PCR產物克隆時，應該轉化UNG-（UNG缺陷）大腸桿菌受體菌，否則轉化產物會被受體菌UNG消化掉。

4.固相捕獲法

用于去除標本中污染的核酸和雜質，原理如下：

（1）用一生物素標記的單鏈RNA探針與待擴核酸雜交，雜交區域是非擴增區。

（2）用包被鏈霉親和素的固相載體來捕獲帶有生物素探針的雜交核酸，通過漂洗可去除污染的擴增產物和雜質。

（3）洗脫靶分子后用特異引物擴增非RNA探針雜交區域。第（2）步的漂洗后可用PCR檢測以確定標本是否被擴增產物或重組質粒污染。

5.RS-PCR法（RNA-specificPCR）

也稱為鏈特異性PCR,主要指用于RNA模板的特異性PCR法，該法可明顯降低假陽性而不影響PCR的敏感性。其關鍵在于設計引物，逆轉錄引物的3ˊ端（A區）有20個核苷酸左右為模板的特異性互不序列，5ˊ端20個核苷酸（C區）為附加修飾堿基。與mRNA逆轉錄后，經超速離心使cDNA與多余引物分開，再用和第二引物（C）以第一鏈cDNA為模板合成第二鏈cDNA,以后的PCR循環中用逆轉錄引物的B區和引物C進行擴增加尾cDNA,而污染的DNA或質粒DNA才不會被擴增。

6.抗污染引物法

該對引物擴增時通過病毒DNA克隆如入質粒的位點。這一區域只存在完整的原病毒中，在重組質粒中，這一區域分成兩個區域與克隆位點被。如果重組質粒污染了標本，也不能擴增出任何條帶，即使出現了擴增帶，其大小也與預期的不同。只有原病毒DNA才能被引物擴增，因此只要出現預期大小的擴增帶就可以證明標本是陽性的，該法試用于環狀靶分子系列。