PCR疑難問題解答第二篇：熒光定量PCR（一）

       實時熒光定量PCR（quantitative PCR, qPCR）通過對PCR擴增反應中的每一個循環產物熒光信號的實時監測從而實現對起始模板的定性及定量分析。目前它主要通過兩種方式——熒光染料或者熒光標記的探針對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線監控反應過程，并結合相應的軟件對產物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。

    熒光定量PCR，qPCR

       熒光染料法

       在PCR反應體系中，加入過量熒光染料，該染料只與雙鏈DNA小溝結合，并不與單鏈DNA鏈結合，而且在游離狀態不發出熒光，只有摻入DNA雙鏈中才可以發光，因此，在PCR體系中，隨著特異性PCR產物的指數擴增，每個循環的延伸階段，染料摻入雙鏈DNA中，其熒光信號強度與PCR產物的數量呈正相關。

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       EvaGreen、SolisGreen、SYBR染料

       熒光染料包括飽和熒光染料和非飽和熒光染料，非飽和熒光染料的典型代表就是現在最常用的SYBR GreenⅠ,EvaGreen、SolisGreen屬于飽和熒光染料。非飽和熒光染料在濃度高的時候會對PCR過程產生抑制，所以在熒光定量實驗時使用濃度稍低，染料不能占據DNA雙鏈上的所有位置。當PCR隨著溫度上升，雙鏈逐漸解鏈，染料會從已解開的單鏈上脫落，然后結合到臨近的尚未解鏈的雙鏈中去繼續發熒光。這種染料重排導致在較小的溫度變化內，雖然DNA雙鏈的解鏈過程不同，但熒光值是幾乎不變的，也就是說，其溶解曲線不能精確反應雙鏈的解鏈情況。

       所以，對于非飽和染料，其溶解曲線分辨率相對較低，只能區分特異性的產物，不能分辨單堿基的差異。飽和熒光染料在DNA雙鏈中所有可結合位點內都會有染料分子存在，染料與DNA的結合呈飽和狀態，隨著溫度上升，在雙鏈解鏈、染料脫離過程中，未解鏈的雙鏈部分不存在染料可以結合的位點，染料不能發生重排。所以使用飽和染料制作的溶解曲線分辨率很高，可以精確反映DNA雙鏈隨著溫度的解鏈情況，精度可以達到單堿差異的區分。

       熒光標記的探針法

       PCR擴增時，加入一對引物的同時再加入一個特異性的熒光探針。該探針為一直線型的寡核苷酸，兩端分別標記一個熒光報告基團和一個熒光淬滅基團， 探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收，PCR 儀檢測不到熒光信號； PCR擴增時（在延伸階段），Taq 酶的5'→3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條 DNA 鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與 PCR 產物形成完全同步，這也是定量的基礎所在。

       染料法VS探針法

       1.探針法通過探針可以增加反應收集信號的特異性，只有探針結合的片段上發生擴增才能收集到信號，探針法能夠用多重體系反應，能夠預測和提前進行反應條件的優化，缺點是要合成探針，成本高

       2.染料法經濟實惠，可以做溶解曲線，分析全部PCR產物的TM值，缺點就是特異性沒有探針法好