5. touchdown PCR
原理很簡單,但的確是一個很有用的方法。舉個例子就OK, ANNEALING TEMP. 55度
94 5min
94 30s
60 30s
72 1min 2cycles
94 30s
59 30s
72 1min 2cycles
94 30s
58 30s
72 1min 2cycles
........
94 30s
51 30s
72 1min 2cycles
94 30s
50 30s
72 1min 20cycles
72 5min
6. hot start PCR
熱啟動PCR是除了好的引物設計之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。盡管Taq
DNA聚合酶的最佳延伸溫度在72℃，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進行PCR反應配制過程中，以及在熱循環剛開始，保溫溫度低于退火溫度時會產生非特異性的產物。這些非特異性產物一旦形成，就會被有效擴增。在用于引物設計的位點因為遺傳元件的定位而受限時，如site-directed突變、表達克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構建和操作，熱啟動PCR尤為有效。
限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應液，并將其置于預熱的PCR儀。這種方法
簡單便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特異性產物的擴增。
熱啟動通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達到變性溫度。包括延緩加入Taq DNA聚合
酶，在反應體系達到90度時，PAUSE，將溫度保持在70度以上，手工加入polymerase，但這個方法 過于煩瑣，
尤其是對高通量應用，并容易造成污染。其他的熱啟動方法使用蠟防護層將一種基本
成分，入鎂離子或酶，包裹起來，或者將反應成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環時，因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起。有很多公司提供這樣的酶。
ampliwax PCR Gems (Perkin Elmer)
Taq Bead Hot Start Polymerase (Promega)
Magnesium wax beads (Stratagene).
象手動熱啟動方法一樣，蠟防護層法比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量應用。還有一種方法是使用inactive DNA Polymerase.
polymerase被抗體抑制失活，當變性溫度超過70度時，抗體也變性了，這樣polymerase又被激活了。
7. Booster PCR
我們知道1ug human genomic DNA 大約在3X105冪個模板分子,這樣的模板分子數目可以是引物與模板很好的結合.
當模板的濃度過低,比如低于100個分子時, 引物和模板之間就很難發生反應. 引物容易自身進行反應形成二聚體.這樣就有來了個 booster
PCR
我一直找不到合適的詞來翻譯這個booster.具體是這樣的.開始幾個cycles保持primer的低濃度,保證primer:template的molar
ratio在10 7~ 10 8. 以確保開始擴增的準確性.然后booste Primer的濃度到正常的水平
8. 循環數和長度
確定循環數的基本原理是: 產物能夠保證你進一步分析操作的最小循環數.因為過多的循環數容易造 成ERRORS和非特異性產物的積累 產物的量不夠, 優化的方法有:
1. 增加TEMPLATE
2. 增加循環數
如何確定循環數,有一個方法.做一個PCR體系,40循環,50ul,
分別在20,25,30,35循環時從體系中取5ul,一起跑電泳分析.從而確定最佳的循環數另一個會影響PCR特異性的是PCR
cycling時在兩個溫度間變化的速率(ramping rate).當然是越高
越好.不過咱們大部分條件有限,就那么幾臺PCR儀,也沒有多少挑選的余地
9. thermal cycler
PCR儀的因素我們經常容易忽視.長時間的使用后需要調整PCR儀,以保證其能夠到達正確的溫度.現在的PCR儀基本上都有自檢功能(self-diagnosis).
10. PCR additives
附加物或者說enhancer實在是多種多樣. 基本上包括幾類, 能夠增加反應退火效率的化學因子, DNA結合蛋白和一些商業試劑.
基本的原理不外是增加引物退火特異性,減少錯配, 增加產物的長度和產量.在GC Rich情況中,
additive可以造成配對堿基間的的不穩定,從而提高擴增的效率.而在另一種情況下,additive由于造成錯配的primer-template復合物的極大的不穩定,
而提高了擴增的忠實性.要注意的是,沒有萬能的enhancer全部通用,需要你根據自己的情況,最好結合gradient pcr選擇最優條件.
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dimethyl sulfoxide(DMSO) up to 10%
formamide at 5%
trimethylammonium chloride 10-100uM
detergents such as Tween 20 0.1-2.5%
polyethylene glycol (PEG)6000 5-15%
glycerol 10-15%
single stranded DNA binding proteins
Gene 32 protein 1nM
E.coli single-stranded DNA binding protein 5uM
7 deaza-dGTP(for GC rich) 150uM with 50uM dGTP
Taq Extehder (stratagene)
Perfect Match PCR Enhancer(stratagene)
Q-solution(Qiagen)
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要注意的是,DMSO,GLYCEROL等會抑制polymerase的活性,所以需要scouting出最適的濃度
11. Template DNA preparation
提取DNA時的試劑會抑制PCR反應的順利進行.因此需要對TEMPLATE DNA進行純化.特別是SDS(<0.01%)
的情況下就能強烈抑制PCR的進行. 可以加入一些nonionic試劑,如Tween, Nonid, Trition之類的反過來抑制SDS.
還有proteinase K也要除干凈, 不然會降解polymerase.
12. Nested PCR
簡單點說 設計兩對引物, 一對是長的, 一對是包含在長引物內的, 用長引物擴增的產物作為第二次擴增的模板,這樣可以增加產物的量. 而且可以減少非特異性帶和錯配的情況.
增加PCR的保真性
高保真酶
高溫DNA POLYMERASE是以單鏈DNA或RNA為模板，在dNTP和一些陽離子的存在情況下，在特定的引物指導下按3'-5'方向合成DNA.包括3種類型
a.5'-3'方向的DNA合成能力,沒有3'-5'方向的外切酶特性.如Taq及其突變體.這類酶的合成能力強,因為他不糾正合成中出現的突變
b.與a類似,有合成活性,沒有3-5的外切活性.但他們能以RNA為模板,合成DNA. 如Tth DNA Polymerase
c.有DNA聚合活性,沒有逆轉錄活性,但有3-5方向的外切酶活性.如pfu DNA Polymerase.可以提高忠實性。但是這些聚合酶的產量比Taq DNA聚合酶低。
酶的混合物
將Taq DNA聚合酶同帶有3'到5'外切核酸酶活性第二種聚合酶混合在一起可以獲得比單獨Taq DNA聚合酶高的忠實性，并可以得到高產量及擴增長模板。
其他因素
除了酶，高濃度的dNTP或鎂離子會降低忠實性。將dNTP的濃度從200μM降低到25-50μM可以增加精確度如果四種核苷的濃度不同，忠實性會受影響。進行較少的PCR循環也會有助于增加忠實性，因為增加循環數目和產物長度就會增加突變可能性。