PCR進階——GCRich片段的擴增策略

　　PCR早已是分子生物學實驗的常規技術，但是GC-rich擴增始終是有難度的應用。

　　以人基因組為例，大約3%的序列可劃為GC-rich序列，尤其是在啟動子，增強子等控制元件，GC-rich序列更為常見。因此，GC-rich片段的PCR擴增困難，也就阻礙了有關這類序列的科研進展。

　　GC-Rich片段案例：FMR1

　　脆性X綜合征(Fragile X Syndrome)是一種X連鎖遺傳病，是最常見的遺傳性智能障礙疾病之一，發病率僅次于唐氏綜合征。致病原因是X染色體上FMR1基因(CGG)n擴展突變，導致維持腦部正常神經傳導的FMRP蛋白缺乏，患者會有嚴重的智力低下、發育遲緩、語言障礙和行為問題，包括多動癥、自閉癥、注意力不集中和伴有癲癇等癥狀。

　　GC-Rich片段的擴增策略

　　在此先給出一般定義上的GC-Rich定義：Master P綜合多種論文文獻及產品技術文檔等，對于一個片段內GC含量高于65%即可認為是GC-Rich片段。值得注意的是，根據個人經驗，如果一個片段只有部分是GC-Rich，導致全部序列統計時并未顯示GC-Rich——這需要更細心的序列分析，如使用Oligo軟件等——這類片段的擴增也應歸屬于GC-Rich擴增。下圖展示了兩種不同的GC-Rich片段類型。

　　GC-Rich擴增困難的原因

　　模板變性更難：GC-Rich區域顯然變性更不容易，可能存在變性不足的情況。

　　退火過程中變性的模板更容易復性：正如之前介紹的，引物-聚合酶-模板這“三位一體”（complex）要緊緊的在一起才能保證延伸進行。當這個三位一體遇到局部復性為雙鏈的模板時，顯然是不利于延伸的。

　　模板形成分子內的二級結構，干擾PCR的進行：上面兩條是Master P推斷的，此條有文獻可查3。

　　dNTP的等濃度性：此條也是Master P推斷的。通常PCR Master mix或者單酶產品中的dNTP mix中，四種單核苷酸濃度比例1：1：1：1，很像某龍魚的調和油一樣，人人生而平等。但是，擴增GC-Rich必然要使用更多的dCTP和dGTP，dNTP的摻入是一個隨機的過程，即，酶-引物-模板復合體周圍dNTP通過隨機熱運動，恰好進入酶催化部位的構象內，DNA鏈+1個核苷酸，那么，四種等濃度的dNTP客觀上給這類擴增制造了“難度”。Master P有條件買到四種dNTP的單核苷酸溶液，并使用較高濃度的GC做過此類驗證（Data not shown）。

　　GC-Rich片段的擴增策略

　　 引物設計策略

　　Li-Yan Li等4與高梅等5分別表了一篇關于GC-Rich 片段的引物設計方法。簡單概來說，就是要將引物的Tm值設計的高一些，最好大于65℃，并且上下游引物的Tm值差（△Tm）要小，這種設計策略對擴增GC-Rich片段是有效的。

　　熱循環參數設置策略

　　兩步法：適合高Tm的引物，好處如前述，不會因為低的退火溫度造成模板復性或者二級結構形成。且高退火溫度有利于增強特異性（見核酸退火研究）

　　三步法：

　　在以下情況使用1，無法設計高Tm的引物，2，引物既定，不重新設計。3，GC%在70%以下。注意：三步法是次優選擇，能使用兩步法則不用三步法。