PCR組裝反應

氯化鎂Rockstart 緩沖液three-reaction 主混合液瓊脂糖凝膠

PCR 儀PCR 管

一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

氯化鎂,35 mmol/L

Rockstart 緩沖液（http://klentaq.com)

three-reaction 主混合液

82ul 5mol/L 的甜菜堿

3.2ul 每一種濃度為 10 mmol/L 的 dNTP 混合物

1ul Klentaq LA 酶混合物（Clontech 8421-1)

6.3ul 左側 PCR riboprimer(儲存液濃度10umol/L)

6.3ul 右側 PCR riboprimer(儲存液濃度 10umol/L)(沒有模板）

153.5ul H₂0 補至總體積 252ul

2. 凝膠

瓊脂糖凝膠，1.4%

3. 特殊設備

PCR 儀

PCR 管

二、方法

1. 向 3 個 PCR 管中都加入 10ul Rockstart 緩沖液和 10ul 35 mmol/L 的 MgCl2，讓加入成分靜置混合至少 15 min 以形成鎂沉淀（BarnesandRowlyk2002)。

2. 準備 three-reaction 主港合液。

3. 在鐵沉淀形成之后，向每個包括 Rockstart 沉淀的反應管中添加 80ul 的 three-reaction 主混合液。

4. 加入 1ul 或2ul的 40mer 的混合物，濃度是每種 40mer lpmol/ul。混合與否并不重要。以 93°C 1 min、62°C 20 min 進行 25 個循環。

5. 在 1.4% 的瓊脂糖凝肢電泳分析 15ul 的 PCR 產物。