PCRArray簡單實用的檢測基因表達的高通量方法（一）

簡介：什么是PCR芯片？ 實時定量PCR是檢測基因表達最靈敏，最可靠的方法。通過在試驗過程中，實時監測熒光染料的信號變化，反映樣品中的基因拷貝數。實時定量PCR線性范圍廣（能達到5個數量級），因此可以檢測同一樣品中表達量極低的基因和表達量很高的基因。但是，由于實時定量PCR需要制備標準曲線和同時分析內參基因，因此，每次實驗只能檢測少數幾個基因的表達水平，若要檢測大量基因，則工作量巨大，耗時長久。   通過簡單的，經過優化的實時定量PCR體系，如SuperArray的RT²Profiler^TM PCR芯片，研究者可以同時研究大量基因，既可以進行某些特別感興趣的信號通路的研究，也可以作為驗證芯片結果的方法。   為了獲得理想的實驗結果，PCR芯片面臨以下挑戰：高特異性，高靈敏度和可重復性。高靈敏度或低檢出限，在樣品的總RNA量少，基因表達量低的情況下，也能檢測出目的基因。高特異性，擴增產物嚴格保證基因特異性，避免非特異性產物，如引物二聚體的產生。可重復性，通過標準化的反應體系和實驗方法，使得多人多次重復實驗均能獲得可靠的基因定量結果。
PCR芯片實驗操作步驟 采用PCR芯片進行實驗只需2小時。PCR芯片實驗過程如圖1所示：首先將RNA樣品反轉錄為cDNA第一鏈，作為PCR模板；接著，將模板加入到反應體系（RT² Real-Time^TM  SYBR Green PCR Master  Mix）中。在已經固定好基因特異性引物的96孔板各孔中，加入等量的PCR反應體系，進行PCR反應。采用儀器配套的軟件計算PCR芯片中的每個基因的循環閾值（Ct）。最后，采用△△Ct方法比較對應的兩個樣本中同一基因的表達量變化。通過分析看家基因Ct值的一致性，可確定合適的標準化方法。芯片所設置的對照，可以檢測PCR體系中是否存在DNA污染，或者是否有影響反轉錄或PCR實驗步驟的因素存在。     圖一 PCR芯片實驗流程