2)電泳
取10μlPCR產物，加入10μl變性劑(95%甲酰胺，10mmol/LEDTA，0.02%溴酚藍)、30μl
石蠟油，煮沸5min，取出立刻放入冰浴中2min以上，然后將水相全部上樣，10-15℃下電泳.開始在300V電壓下電泳5min，然后在120V電泳8h，取下凝膠，將其浸在含
0.5ug/ml溴化錠的1×TBE緩沖液中染色30--45min，在紫外燈下觀察，或進行銀染。
3)銀染法
將PAG板用去離子水洗二次，浸入10%乙醇和0.5%冰醋酸溶液固定6min。用去離子水洗
二次，再浸入0.2%AgNO3溶液中10min。用去離子水洗3--5次，然后浸入1.5%NaOH和0.4%甲醛溶液中顯色7min.最后，用
0.75%NaCO3終止顯色.
四、SSCP的應用
自從Orita等用SSCP進行人類DNA多態性分析以來，該方法大量地用于檢測和腫瘤發生
有關的基因突變，例如檢測星形細胞瘤、腦瘤、小細胞肺癌、胃癌、腸癌等腫瘤中的
p53基因的突變、肺癌的ras基因突變等.最近Sugano等用銀染色SSCP法，成功地檢測
了c-Ki-ras2基因第12位的突變，電泳和銀染色過程在2.5小時內完成。SSCP還用于檢
測引起人類遺傳性疾病的研究上，如在囊性纖維化中起作用的CFTR基因、神經纖維瘤1型基因、家族性結腸息肉基因的研究中.最近，Sharkar等用
RNA-SSCP法檢測了28名B 型血友病患者的凝血因子IX的基因序列，并與DNA-SSCP和直接基因測序法進行了比
較，發現在全長2.6kbp的凝血因子IX基因組中，有20處堿基點突變，RNA-SSCP可檢測
出其中的70%，而DNA-SSCP只能檢測出35%，顯示了RNA-SSCP比DNA-SSCP有更高的靈敏性。
SSCP法除大量地用于基因突變的檢測外，還用于病毒的分型、監測PCR實驗中的污染情況、以及病原體傳播途徑的研究中。Yap用巢式PCR對來自不同國家和地區的HBV標品
進行了檢測，并對擴增產物進行了SSCP分析，發現每個標本的SSCP圖譜完全不同，不僅證明了HBVDNA具有地區性變異，而且排除了交叉性污染的可能性，為保證PCR診斷結果的可靠性找到了好方法。另外，Yap等還將SSCP用于DNA定量分析上，他們將SSCP
與競爭性PCR法相結合進行乳腺癌細胞突變p53基因的定量分析，并取得了初步成功。該方法的優點在于，內標和待測DNA只有一個堿基不同，這樣使內標和待測DNA有相同的擴增條件，從而更準確地測出DNA的量。從以上可以看出，SSCP正在分子生物學領域
發揮著巨大的作用。
五、SSCP注意的事項
SSCP是一種快速、簡便、靈敏的檢測基因突變的方法，為了使SSCP達到最佳效果，應注意下列事項。
①重復性.影響SSCP重復性的主要因素為電泳的電壓和溫度.這兩個條件保持不變，
SSCP圖譜可保持良好的重復性。一般SSCP圖譜是二條單鏈DNA帶，但有時有的DNA片段
可能只呈現一條SSDNA帶，或者三條以上，這主要是由于兩條單鏈DNA之間存在相似的立體構象。有時三條以上的SSCP圖譜是由于野型DNA片段和突變型DNA片段共同存在的結果。
②靶DNA序列長度的影響在實驗中發現SSCP對短鏈DNA或RNA的點突變檢出率要比長鏈的高，這可能是由于長鏈DNA和RNA分子中單個堿基的改變在維持立體構象中起的作用
較小的緣故.而有人認為在DNA鏈較短的(400bp以下)情況下，DNA的長度不會影響SSCP
的效果。他們仔細選擇了實驗條件，發現354bp的DNA中點突變的檢出率仍可達到90%以上。
③電泳電壓和溫度的影響:為了使單鏈DNA保持一定的穩定立體構象，SSCP應在較低溫度下進行(一般4℃-15℃之間).在電泳過程中除環境溫度外，電壓過高也是引起溫度
升高的主要原因，因此，在沒有冷卻裝置的電泳槽上進行SSCP時，開始的5min應用較
高的電壓(250V)，以后用100V左右電壓進行電泳.這主要是由于開始的高電壓可以使
不同立體構象的單鏈DNA初步分離，而凝膠的溫度不會升高.隨后的低電壓電泳可以使 之進一步分離.在實驗中應根據具體實驗條件確定電泳電壓。
④DNA片段中點突變的位置對SSCP的影響點突變在DNA和RNA中的位置對SSCP檢測率的
影響，取決于該位置對維持立體構象作用的大小，而不是僅僅取決于點突變在DNA鏈
上的位置(有人認為點突變在DNA鏈中部要比在近端部容易被SSCP檢測出來).White曾
設計了一組樣品DNA片段，并將其中的點突變設在DNA鏈的中部，而且該點又正處在發
夾結構頂端的環上，結果發現SSCP只能檢測出9個樣品中的2個(檢出率為22%)，說明
DNA鏈中任何部位的突變，只要對其單鏈立體構象沒有影響，都有可能被漏檢。
⑤SSCP的結果斷定：由于在SSCP分析中非變性PAG電泳不是根據單鏈DNA分子和帶電量 的大小來分離的，而是以單鏈DNA片段空間構象的立體位阻大小來實現分離的，因此，這種分離不能反映出分子量的大小。有時正常鏈與突變鏈的遷移率很接近，很難 看出兩者之間的差別。因此一般要求電泳長度在16--18cm以上，以檢測限為指標來判 定結果.檢測限是指突變DNA片段與正常DNA片段可分辨的電泳距離差的最小值。大于檢 測限則判定鏈的遷移率有改變，說明該DNA序列有變化，小于檢測限則說明鏈之間無變化.例如，一般檢測限定為3mm，那么當兩帶間距離在3mm以上，則說明兩鏈之間有 改變.另外檢測限不能定的太低，否則主觀因素太大，易造成假陽性結果.另外，SSCP 分析中其它條件，如PCR產物的上樣量，PAG的交聯度、以及膠的濃度等，都應根據具體實驗進行選擇確定。總之，SSCP分析法是一種快速、簡便、靈敏的突變檢測方法， 適合臨床實驗室的要求.它可以檢測各種點突變，短核苷酸序列的缺失或插入。隨著 SSCP分析不斷完善，它將成為基因診斷研究的一個有力工具。