PacBio單分子測序揭示丹參葉綠體DNA修飾的相互作用

　　2014年6月10日，中科院藥用植物研究所（IMPLAD）劉昶團隊在《PLOS ONE》雜志上發表了利用PacBio測序技術揭示丹參（Salvia miltiorrhiza）葉綠體DNA修飾之間復雜相互作用的相關文章，該文章報道了丹參葉綠體中編碼及非編碼RNA的表達情況。這也是國內PacBio第三代測序用戶在國際性雜志發表的第一篇文章。

　　丹參是最廣泛使用的藥用植物之一。作為基于葉綠體基因工程手段開發使丹參活性成分過表達方法的第一步，該研究團隊從基因組，轉錄組，和堿基修飾三方面對丹參葉綠體進行了分析。先從新鮮葉片中提取總基因組DNA和RNA，然后進行鏈特異性RNA測序和 PacBio公司的單分子實時（Single-Molecule Real-Time, SMRT）測序分析。

　　實驗先是將RNA測序得到的reads mapping到基因組，使該研究小組確定了80個蛋白質編碼基因的相對表達水平。此外，還明確了19個多順反子轉錄單元和136個假定反義和基因間非編碼RNA（ncRNA）基因。將蛋白編碼基因的轉錄本（cRNA）豐度與重疊反義非編碼RNA（asRNA）相比較表明，asRNA的存在與cRNA的豐度增加有關（P<0.05）。使用SMRT Portal軟件預測到了2687個潛在的DNA修飾位點和2個潛在的DNA修飾基序。兩個基序包括TATA盒樣基序（CPGDMM1, ''TATANNNATNA''），以及一個未知的基序（CPGDMM2, ''WNYANTGAW''）。

　　本文用二代和三代DNA測序技術并用，使在基因組層面研究非編碼RNA和DNA修飾成為可能。然而，原來關于反義RNA和DNA修飾研究在實驗上具有相當大的困難。首先，大多數asRNA轉錄本表達水平顯著偏低，因而難以用經典技術如Northern Blot和原位雜交進行驗證。第二，正義和反義轉錄本之間錯綜復雜的關系意味著實驗擾動會不可避免地干擾其他轉錄本的表達。因此，通過knocking -in和knocking-out技術確定轉錄本的生物學功能是復雜的。第三，雖然SMRT技術已被證明能夠檢測到潛在的DNA修飾，但驗證這些修飾仍然是個挑戰性的任務。第四，葉綠體asRNA和DNA修飾的存在和功能的驗證是更加困難的。

　　綜上所述，本研究所描述的一些發現從目前的技術上來講是有巨大進步的。然而，本研究提出的數據已經證實了由asRNA和DNA修飾引起的基因表達調控的復雜性。