PacBioSMRT測序技術揭示第七次霍亂大流行致病菌的來源

　　霍亂是一種由霍亂弧菌引起的可怕疾病。在人類歷史上，自1817年以來，全球曾發生過七次可怕的霍亂大流行。而離我們最近的第七次霍亂大流行起始于1961至今，發源地是印度尼西亞，由此逐漸散布到了全世界。到目前為止，第七次霍亂大流行已經感染的人數大概在每年300-500萬人左右。2010年海地地震后，霍亂也出現了一次大的爆發，導致近70萬人感染，超過8500人死亡。

　　圖1，霍亂弧菌（來自bacteriainphotos.com）

　　對于這樣一個極具歷史意義的細菌性傳染性疾病，現代科學技術能夠研究的致病菌只有第六次（1899-1923）和第七次（1961至今）霍亂大流行。通過血清學分析，第六次由經典型（classical）引起，而第七由El Tor型引起。而經過基因組分析進化樹，發現除第七次大流行外，其他幾次的霍亂菌全部來源于同一個classical型。這也說明第七次大流行并不是由第六次大流行的菌株直接演變而來的。

　　在今天向大家介紹的文章中，作者基于高質量的全基因組測序，對當前所有第七次流行的菌株，包括第七次大流行開始時分離的菌株進行了分析，建立了一個高質量的系統發生樹，描繪了發生遺傳變化的六個階段，并得到了三個清晰的生態型，其中包括了非致病性的環境性霍亂弧菌。而第七次大流行霍亂菌株的進化包括了一些獲得性基因介導的重要變化，而這些基因被認為是來源于環境中的霍亂弧菌，并且在第六次大流行的菌株中也出現過。這說明此前致病性的霍亂弧菌對第七次大流行的霍亂弧菌致病性的形成與進化有著重要的作用。

　　圖2：導致第七次大流行菌株的六個階段。在每個分支上展示了遺傳事件的變化的細節。

　　從以往可用于分析的菌株、包括第七次大流行菌株來看，其研究卻是有局限性的。盡管作者對其中一個菌株（M66-2）進行了完整的基因組測序，并鑒定了一些在形成第七次霍亂大流行菌株過程中的變異事件，但其他的流行性霍亂菌株的基因組信息則相當匱乏，僅有一些菌株的草圖。為了闡明第七次大流行菌株的起源和從第六到第七次大流行的過渡，作者使用PacBio測序技術進行了10個菌株的完整基因組測序，包括來源于中東和孟加錫的3個流行前菌株和4個非常早期（1961-1964年）的第七次大流行菌株，另外還有三個來源于美國（1974年）、澳大利亞（1977年）、中國（1974年）的流行前菌株。

　　表1， 本次研究涉及到的霍亂弧菌測序結果

　　*標記為作者進行全基因組測序的菌株

　　在進行PacBio SMRT測序過程中，作者針對每一個待測的菌株，構建了10kb文庫，采用P4-C2測序試劑進行單分子測序，并用HGAP/Quiver軟件進行了de novo組裝，形成高質量的完整的基因組。隨后，作者還進行了SNP檢測以及進化分析，基因組注釋和比較基因組學分析。在分析過程中，質量更好的全基因組序列信息能夠幫助識別所有的插入缺失片段。

　　圖3，基于排除重組事件后變異差異的21株霍亂弧菌的最大似然進化樹。包括突變、插入缺失、重組等遺傳事件標注于各個分支上。但由于MAK757, NCTC8457, BX330286, 以及2740-80分支缺乏有效的序列數據，因此沒有做具體的分析。

　　圖4，具有完整的基因組序列的8個霍亂弧菌菌株在主要譜系的進化樹，圖中每個分支中所有的遺傳事件都在括號中表示，包括各種大小的插入缺失等。

　　在以往報道中提到，第七次大流行菌株中幾乎沒有重組事件。在本次研究中，也同樣發現，該菌株重組事件頻率非常低，但卻發生了許多突變。本文中，作者認為在第七次大流行及其爆發的過程中，菌株中的低重組頻率，簡單來說，可能是由于霍亂弧菌在大流行期間在環境中經歷的時間較少，在生物進入水體后不久即可發生感染，使得重組的機會大大減少。而低重組率可以使它們進入長期穩定的VBNC（viable but noncultivable）狀態，然后在合適條件下再次進入活性生長狀態從而感染宿主。因而作者通過高質量的全基因組分析發現，導致人類腹瀉的霍亂弧菌并不能與環境中的霍亂弧菌發生重組。

　　在本文中，為了更加全面的分析不同時期采集的霍亂弧菌樣本，需要高質量的全基因組數據，從而更直接的得到突變、插入缺失、重組等遺事件的全方位信息。因此作者利用PacBio SMRT測序技術，分析并比對了進化樹中各個分支上的所有遺傳事件，揭示了針對目前可能的第七次大流行的霍亂菌株的進化史，為該領域提供了一個最清晰的視角。

　　原文信息

　　Hu D, Liu B, Feng L, et al. Origins of the current seventh cholera pandemic[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2016: 201608732.