PacificBiosciences單分子實時測序

Pacific Biosciences單分子實時測序　

Pacific Biosciences單分子實時（SMRT）測序使用特殊的環接頭，通過鏈置換擴增（SDA）或多置換擴增（MDA）從dsDNA片段中生成ssDNA，其基于滾動環擴增（RCA）。然后通過DNA聚合酶加入具有熒光磷酸基團（而不是熒光含氮堿基）的dNTP，磷酸鏈斷裂并發光，有效地從生長的核酸鏈中去除熒光染料。單分子實時測序反應在數千個納米光子可視化室中并行進行，生成測序讀數。然后使用生物信息學工具將它們組裝起來，以生成重疊群、染色體，并最終生成基因組序列。

Pacific Biosciences單分子實時測序優點

首先，樣品制備速度非常快;這需要 4-6 小時而不是幾天。此外，它在制備步驟中不需要PCR，從而減少了PCR引起的偏差和誤差。二是周轉率快;運行在一天內完成。第三，平均讀取長度非常長（10-16 kb），比任何下一代測序技術都要長。雖然通量低于下一代測序儀，但SMRT測序不僅能發出熒光信號，還能隨時間推移產生信號差異，這對于臨床實驗室非常有用，特別是對于微生物學研究，以組裝基因組，并評估結構變異分析、單倍型分析、宏基因組學和剪接亞型鑒定。

Pacific Biosciences單分子實時測序缺點

使用該系統進行直接RNA測序是有問題的。這是因為核苷酸在核苷酸摻入之前反復與逆轉錄酶結合，從而產生多次插入的錯誤信號，從而無法確定有意義的序列。此外，該系統的低讀取計數將限制其識別常見的mRNA亞型，而不是定量表達譜或完整的轉錄組覆蓋率。