PeerJ：如何利用NGS來分析瀕危物種

　　 美國鼠兔（American pika）是一種可愛的小動物，圓滾滾，萌萌噠，人稱美國皮卡丘。由于它們對高溫非常敏感，故棲息在又高又冷的山區，而隨著全球氣候變暖，它們逐漸向更高的山區遷徙。這就為鼠兔的研究帶來了難題。

　　對于這個瀕危物種，研究人員不能采取強硬的手段來捕獲，而只能依靠非侵入性采集的樣本，比如毛發或糞便中的DNA。由于這些樣本中只含有少量的DNA，新一代測序技術是否適用，這可是個問題。

　　近日，加拿大英屬哥倫比亞大學的研究人員給出了肯定的答復。他們通過新一代測序分析，鑒定出美國鼠兔樣本中近4,000個SNP，發現該物種的遺傳變異隨著海拔的變化而變化。這項成果發表在《PeerJ》雜志上。

　　英屬哥倫比亞大學的副教授Michael Russello及其同事利用非侵入性的陷阱，從華盛頓州的北瀑布國家公園采集了12只鼠兔的毛發樣本。研究人員稱，這些樣本的平均起始DNA濃度為0.55 ng/μl，而有些樣本的DNA量甚至低于1 ng。

　　他們采用nextRAD（Nextera-tagmented, reductively-amplified DNA）基因分型技術從美國鼠兔的樣本中收集SNP數據。這種Nextera tagmentation技術來自Illumina，它以轉座酶為基礎，同時完成DNA的片段化和接頭的添加，大大減少了所需的DNA起始量。他們從每個樣本中平均獲得1,863,634個測序讀取。

　　為了確保這些DNA來自鼠兔，他們將測序讀取定位回鼠兔（Ochotona princeps）基因組，發現16個樣本的相當一部分讀取對應了其他的小型哺乳動物，還有2個與人類匹配，1個來自玉米。

　　在其余67個樣本中，研究人員發現了3,803個SNP，而異常值檢測發現37個位點在一個樣帶，18個在另一個樣帶。其中5個位點與已知功能的基因相關，包括ROR2基因，它參與了骨骼和神經發育以及細胞運動和細胞極性；HEPHL1基因，它似乎是鐵氧化酶；以及TMX4，一種跨膜蛋白。

　　研究人員指出，多態性位點的比例隨采樣點的不同而變化。與海拔中等和較高的點相比，在海拔較低的點采集的樣本也有著較少的多態性位點。他們認為，樣帶上的基因多態性也有著類似的趨勢。“我們發現遺傳變異與海拔顯著相關，海拔較低的地方也表現出較低的多態性水平，”研究人員寫道。

　　在金字塔峰（PP）樣帶的較低和中等海拔的點，研究人員發現了明顯的近親繁殖，不過在較高海拔的點卻沒有發現。同時，桑頓湖（TL）樣帶的所有點都表現出近親繁殖的證據。

　　研究人員認為，盡管他們能夠發現鼠兔中的遺傳變異，不過非侵入性采樣仍然具有挑戰性。例如，采樣過程必須盡量限制非目標DNA的采集，以及需要評估獲得的序列，以確保它們來自感興趣的物種。