QExactive中TMT定量工作流程的參數優化和ProteomeDi...（一）

Q Exactive中TMT定量工作流程的參數優化和Proteome Discoverer2.1數據處理方法

Xiaoyue Jiang1, Tabiwang Arrey2, Eugen Damoc2, Michaela Scigelova2, David Horn1, Rosa Viner1, and Andreas F.R. Huhmer1
1Thermo Fisher Scientic, San Jose, CA, USA; 2Thermo Fisher Scientic, Bremen, Germany

關鍵詞
Q Exactive Plus，Q Exactive HF，TMT，Proteome Discoverer 2.1，蛋白質鑒定，相對定量，同量異序標簽，多重定量

研究目標
在 Thermo ScientificTM Q ExactiveTM 儀器平臺上，采用 Thermo ScientificTM TMTsixplexTM 和 TMT10plexTM 工作流程，建立最優的質譜數據采集方法將其應用于蛋白質的相對定量研究中。本文詳細介紹了該工作流程所涉及的樣品前處理、肽段分離和質譜分析等過程，以及采用 Thermo ScientificTM Proteome DiscovererTM 軟件 2.1 版本對數據進行處理和分析的具體流程。

背景介紹
同量異序標簽（如 Tandem Mass 標簽TM （TMTTM）1 或 isobaric Tag for Relative and Absolute Quantification（iTRAQ?）2）是基于質譜技術的蛋白質相對定量方法中非常常見的一種。3-6 其中，基于 TMT 標簽的多重相對定量方法具有很多優勢，包括整個實驗周期更短、波動更小，樣品通量更高，以及樣品間定量數據的缺失更少等。標記氨基的 TMT10plex 與 TMTsixplex 反應試劑的化學結構相同但是前者在質量報告區域中可以提供更多的 13C 和 15N 同位素組合形式。對于某些組合間彼此僅相差一個中子的質量，需要高分辨率的分析儀器實現串聯質譜譜圖采集才能進行區分。

Thermo ScientificTM TribridTM 質譜儀家族，包括 OrbitrapTM FusionTM MS 和 Orbitrap Fusion LumosTM MS 儀器，所提供的同步母離子選擇（SPS）MS3 方法能夠在具有高動態范圍的復雜樣品中實現最為準確的 TMT 定量分析。7，8 而 Thermo ScientificTM Q ExactiveTM 質譜儀系列儀器，結合了四極桿對母離子選擇的高選擇性和高特異性與 Orbitrap 質量分析器的高分辨率和準確質量（HRAM）檢測能力的優勢，也是進行同量異序定量分析的一把好手。Thermo ScientificTM Q ExactiveTM Plus 質譜儀通過配備改進的四極桿技術（AQT）以優化離子選擇能力和傳輸效果，同時提高了在窄小的隔離窗口內對低豐度離子進行定量分析的能力。9 Thermo ScientificTM Q ExactiveTM HF 質譜儀引入了超高場 Orbitrap 質量分析器，能夠以兩倍于 Q Exactive Plus MS 的掃描速度實現高分辨率檢測，表現出了更為優異的性能。9

基于 Q Exactive 質譜儀的 TMT 標記定量分析流程，不僅能夠實現肽段和蛋白質鑒定結果的最大化，而且能夠同時為多達十個不同樣品提供高定量準確度的相對定量結果。該流程的前提是需要良好的色譜分離效果、充分分辨的質譜峰、足夠的離子豐度，以及能以高掃描速度采集高質量的 MS2 碎裂譜圖。本應用文檔為 TMT 標記及其相對定量策略提供了詳細的分步指導，包含樣品前處理、儀器設置，以及采用 Thermo ScientificTM Proteome DiscovererTM 2.1 軟件對多重定量數據進行處理和分析。本文詳細討論了關鍵儀器參數（分辨能力、最大注入時間、自動增益目標值、碰撞能量和隔離窗口等）對蛋白質和肽段鑒定以及定量結果的影響，以保證用戶能夠參照本文成功地在 Q Exactive 系列質譜儀上建立 TMT 定量工作流程。

實驗方法

TMT 標記
采用 Thermo Scientific TMT 試劑對 E. coli 酶解產物標準樣品（Waters? Corp，Milford，MA）按如下步驟進行標記：
1. 將三乙胺碳酸鹽 （TEAB） 緩沖液、TMT 標簽和干粉狀態下的樣品從 -20 ℃ 轉移至室溫下平衡。
2. 將 500 μL 溶解緩沖液 （Dissolution Buffer，1 M TEAB） 加入到 4.5 mL 超純水中，制備 100 mM TEAB 溶液。
3. 將單個樣品（不超過 100 μg/TMT 標簽） 溶于 100 mM TEAB 緩沖液，得到 1 μg/uL 的樣品溶液，充分渦旋振蕩，放置 10 分鐘。
4. 在每個 TMT 試劑瓶中加入 41 μL 新鮮 LC-MS 級乙腈，充分渦旋振蕩，放置 10 分鐘。
5. 在每個 TMT 試劑瓶中加入不高于 100 μL 第 3 步中制備的樣品溶液，渦旋振蕩，孵育 1 小時。
6. 反應 1 小時后，向每個小瓶中加入 8 μL 5% 羥胺（將試劑盒中提供的 50% 羥胺儲備液用水稀釋 10 倍）以終止反應，孵育 15 分鐘。
7.標記結束后，立即按所需比例混合不同樣品。在本研究中，TMTsixplex 試劑（通道 126-131）的混合比例為 20:10:1:1:10:20。所選六種 TMT10plex 試劑（通道 127C，128N，128C，129N，129C，130N）以相同比例混合。
8. 將制備好的樣品分成小份，干燥，在 -80 ℃ 下儲存。
9. 進行 LC-MS 分析前將制備好的 TMT-標記樣品重懸于 0.1% TFA/5% ACN （v:v）溶劑中；重懸好的 TMT-標記樣品能夠在 4 ℃ 穩定保存一周，避免反復凍融。
為考察定量分析的準確度，將 Thermo ScientificTM PierceTM HeLa 蛋白酶解產物標準樣品（P/N 88328）按上述流程進行標記，將 TMTsixplex 通道 129–131 和 TMT10plex 通道 127N、127C 和 128N 分別以 10:10:10 比例混合，然后加入 E. coli 樣品中，每通道比例為 1:1（33 μg HeLa 酶解產物 + 67 μg E. coli 酶解產物）。

液相色譜
色譜分離條件設置詳見表 1。進樣量相當于 1 μg 起始蛋白質。

質譜儀
通過液相色譜洗脫得到的肽段分別由 Q Exactive Plus 和 Q Exactive HF 質譜儀在數據依賴采集模式下進行分析。儀器參數設置參見表 2。

表 2. 采用 Q Exactive Plus 和 Q Exactive HF 儀器分析 TMTsixplex 和 TMT10plex 標記樣品的推薦儀器參數設置