4. 工作流程設置和定量比值的定義
首先在 workflows tab 下打開 Processing Workflow。模板里已經包含了質量數容許偏差、報告離子定量分析說明和常見修飾，只需要再細化以下幾個參數。
1. 在 Processing Workflow 的 SequestHT 節點下，選擇 Protein Database。可同時選擇多個蛋白質數據庫。
2.
在 Processing Workflow 的 SequestHT 節點下，指定 TMT 為肽段氮端和賴氨酸殘基上的 static
modification。（請注意：TMTsixplex 和 TMT10plex 都對應 229.163 Da 質量增加）。
3. 在報告離子定量節點下，確認 MS 級別是 MS2。
4. 打開 consensus Workflow ，選擇 Protein Marker 節點。選定需要在結果中標示的蛋白質。因為樣品是 E. coli 和人源蛋白的混合物，定義兩類標志物便于后續分析（E. coli 和人類的） （圖 5）。
5.進入
Peptide and Protein Quantifier 節點。將 Apply Quan Value Corrections 設置為
True，Co-Isolation Threshold 設為 50， Average Reporter S/N Threshold 至少設為
10（圖 6）。Scaling Mode 選用 On Channel Average （Per
File），這樣對于每個平行分析結果來說，其中每個通道的豐度值都會進行按比例縮放。更多關于參數如何設置的細節參見參考文獻 11。
6. 將 .raw 從 Input Files 標簽下拖到右側 Analysis 條目下的指定區域內。
7.
進入 Grouping & Quantification
條目并指明研究中的變量。該設置會決定定量分析結果分組和顯示的方式。本例中選擇了 Quan Channel 和 isolation
windows，因此平行分析的結果會按不同隔離窗口分組并取平均，使其能夠非常方便地在最終報告中進行比較。具體操作方式是選定這兩個變量，并通過選擇每個變量左側的上下箭頭把
isolation windows 移到 Quan Channel 上方。請注意變量的順序會影響 Bulk Ratio Generation
中的分組方式。選定對照組 130N Quan Channel 作為這兩個提取窗口的 Denominator， 再選 Add
Ratios。Generated Ratios 參見圖 7。更多關于如何設置研究變量的細節請參見參考文獻 11。
8. 點擊 Analysis 右上角的 Run，開始運行 Job Queue 中的 Processing 和 Consensus Workflow 搜索。
圖 5. 本研究 consensus Workflow 中 Protein Marker 節點處的設置。
圖 6. Consensus Workflow 中 Peptide and Protein Quantifier 節點處的參數設置。
圖 7. 進行比例計算時 Grouping & Quantification 標簽的內容。
5. 蛋白質和肽段鑒定以及定量結果分析
1. 搜索結束后，選亮 Consensus search，選 Open Results。或者進入 Analysis Results 條目，選亮分析行再選擇 Open Results。
2. 蛋白質和肽段的分組數量顯示在屏幕下方。
3. 對每個蛋白質/肽段組，根據蛋白質標志物節點中設置的物種歸屬結果也被顯示出來（圖 8）。
4. 進入工具欄 View 條目，選擇 Display Filter。從全部文件中過濾所有被鑒定為源于 E. coli 的蛋白質組和肽段組（圖 9）。
5. 要得到兩個研究因素中每個因素下的鑒定結果總數，使用如圖 10 所示的條件進行濾篩。
6. 要得到可定量的肽段數量，進入 View，選擇 Distribution Charts。在 Bar Charts 中選擇 Peptide Groups-Quan Info 可以顯示有和沒有 Quan Values 的肽段組（圖 11）。
7. 如 Grouping & Quantification 標簽中所設計的，每個條件下的兩個平行分析的定量比值被分在一組并取平均，即如 Abundance Ratios 欄所示 （圖 12）。此外，Grouped 和 Scaled Abundances，平行分析間的 Standard Error，以及每個平行分析數據組的 Scaled Abundances 都被顯示出來（圖 13）。這些功能使得對不同條件下的定量分析結果進行比較易如反掌。
圖 8. 根據物種來源標識的蛋白質。
圖 9. E.coli 蛋白質組（上圖）和肽段組（下圖）鑒定結果濾篩。