數據處理
采用
Proteome Discoverer 軟件 2.1 版本（PD 2.1）進行數據處理。該軟件的特色是提供了全新改進版的 TMT
定量分析工作流程，其新功能包括：1）可用于添加報告離子同位素分布的全新用戶界面；2）解析 TMT10plex
試劑中報告離子同位素雜質的能力；3）實現基于信噪比（S/N 值）的 TMT 定量分析；4）根據 S/N 值歸總進行蛋白質和肽段定量分析；
5）提供對肽段和蛋白質豐度值進行歸一化和標準化新方法。
在 Proteome Discoverer 2.1 軟件中設置數據處理流程的關鍵步驟詳細描述如下：
1. 建立研究專用定量分析方法
在開始新研究之前，通常需要先更新定量分析方法，其編輯流程為：
1. 進入 Administration，選擇 Maintain Quantification Methods。其中提供了常用定量分析方法的模板。
2. 選擇 Add，從已有方法中選擇模板。每個已有 TMT 定量分析模板都包含了殘基/肽段氮端的修飾和報告離子的同位素分布。
3.同位素分布值應按照該研究所用
TMT 試劑分析證書（CoA）中提供的信息進行添加。相關信息可在
http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/90110?ICID=search-product
上通過試劑瓶上的批次號查詢獲得。
4. 根據研究需要，在“active”列中選擇/去除報告離子通道。
5. 保存新創建的定量分析方法。新創建的研究專用定量分析方法參見圖 1。
2. 導入 FASTA 數據庫
1. 在 Administration 條目下打開 Maintain FASTA Files。
2. 用 Add 功能導入本地硬盤上已有的 .FASTA 文件。
3. 另一種方法是使用 Download 功能，鍵入 taxonomy ID，從蛋白質中心下載數據庫文件。
圖 1. 用戶定義的研究專用 TMT10plex 定量分析方法示例。
3. 創建新研究
1. 在 Proteome Discoverer 軟件起始頁面選擇 New Study and Analysis（圖 2）。
2. 定義 Study Name 并指定 Study Directory，將文件保存在特定的文件夾中。
3.
若要進行 Processing Workflow，通過倒三角圖標選擇可用模板，選擇“ProcessingWF_QE
active\PWF_QE_Reporter_Based_Quan_Seque tHT_Percolator.pdProcessingWF”。
4. 若要進行 Consensus Workflow，選擇“ConsensusWF CWF_Comprehensive_Enhanced_Annotation_Quan pdConsensusWF”。
5. 選定第一部分中創建的 Quantification Method，然后選定 Control channel Selection。
6. 導入要處理的 .raw 文件。圖 2 示例中導入了采用兩個不同隔離窗口設置的四份平行分析產生的原始數據文件。
7. 選擇 OK，數據文件會在新窗口打開。
8.
對于涉及平行分析的復雜研究，推薦使用 Study Factors 管理功能進行結果分組、歸一化以及展示。若要添加 Study
Factors，在當前研究頁面選擇 Study Definition tab，選擇 Add
來添加類別或數字類型的因素。鍵入因素名稱和所有相關因素（圖 3）。如無需使用 Study Factor，直接進入第四部分的工作流程設置操作。
9. 在 Input Files tab 條目下應該能夠顯示導入的原始文件。可以用左側三角形圖標展開查看文件細節。根據實驗設置為每個文件和報告離子指明 Sample Type 和 Study Factors。
10. 完成后查閱 Sample tab——此時所有研究因素應當已經自動更新。
圖 2. 全新的研究和分析設置對話界面。
圖 3. 在 Study Factor 管理界面中添加新的研究因素。
圖 4. 單個樣品定量設置的 Study Factors 和定量分析通道