QExactive中TMT定量工作流程的參數優化和ProteomeDi...（五）

MS1 參數

TMT 標記對于母離子來說是真正的同量異序標簽，因此 MS1分辨能力的設置是與未標記樣品完全相同的: 對于 Q Exactive Plus MS 和 Q Exactive HF MS 來說，其分辨率分別為 70,000 和 120,000。這樣的設置足以在不顯著影響數據依賴掃描模式循環時間的前提下，分辨絕大部分共洗脫物質。 推薦 AGC 目標為 3e6，有利于提高全掃的動態范圍。

MS2 分辨能力

MS2 分辨能力不夠會導致背景或雜質離子信號與報告離子信號混為一談，影響對 S/N 的評估。對于 TMTsixplex 標記的樣品來說，分辨率設置為 30,000 能夠保證報告離子與相近報告離子的同位素峰實現基線分離。12

對于 TMT10plex 試劑來說，13C 和 15N 同位素異構體的質量差異僅為 6 mDa。圖 15 中顯示的是不同比例下經 4 通道 （128N，128C，129N，129C）標記的肽段的報告離子區域。30,000 的分辨率設置不足以區分 N 和 C 同位素異構體。對于 TMT10plex 標記的樣品，合適的 Q Exactive Plus MS 和 Q Exactive HF MS分辨率設置分別應為 35,000 和 60,000。

圖 14. 分析 TMTsixplex 標記的 E. coli 和 Hela 混合樣品時，增加進樣量和梯度洗脫時間后可鑒定和可定量的 E. coli 源肽段和蛋白質的數量。

圖 15. 分辨率設置分別為 30,000，35,000 和 60,000 時，TMT10plex 標記肽段報告離子區域細節圖。請注意，在 30,000 分辨率下僅得到部分分離。

MS2 最大注入時間

MS2 最大注入時間需要根據進樣量、樣品復雜程度和洗脫梯度進行調整。通常來說，更長的注入時間能夠積累更多的母離子，報告離子的強度會相應增加，更有利于中低豐度肽段的鑒定和定量分析。如圖 16 所示，最大注入時間從 64 ms 增加到 100 ms 大大提高了可定量蛋白質和肽段的數量，也相應地實現了更高的定量分析率。

如前所述，更長的洗脫梯度需要更長的注入時間。另一方面，注入時間的增加不應該顯著影響儀器的整體速度，尤其是在分析復雜樣品的時候。一個理想的方法是將可允許的最大注入時間設成與 FT 轉換檢測時間匹配，因為該時間是與儀器分辨率設置直接相關的。對于 Q Exactive Plus MS 和 Q Exactive HF MS 來說，128 ms 的 Orbitrap 分析器檢測時間對應的分辨率分別是 35,000 和 60,000，因此使用 100 ms 的注入時間與檢測時間非常匹配，能夠保證離子注入與 Orbitrap 檢測的高效并行。如圖 17 所示，增加注入時間同樣有利于提升定量檢測的準確度。

圖 16. 使用不同儀器設置時，純 E. coli 樣品中可鑒定和可定量肽段和蛋白質組的數量。*方法設置詳情參見表 5。

表 5. 圖 16 中比較的每個方法的詳細參數。