圖 10. 運用本研究中每個研究因素篩選蛋白質組（上圖）和肽段組（下圖）鑒定結果的濾篩。
圖 11. 篩濾后肽段組的定量分析結果總覽。
圖 12. 結果中的 Abundance Ratios 欄。比值分別按 Isolation Windows 和 Quan Channel 排序。比例上調或下調的蛋白質用不同顏色高亮顯示。顏色越深代表變化程度越顯著。
圖13. 每個數據組中蛋白質的豐度（Abundances （Grouped））、標準誤差（Standard Errors）、折合豐度 （scaled Abundances）的圖示說明。
結果與討論
仔細設置每個質譜分析參數對基于
TMT-標記實驗實現絕對靈敏和準確的定量分析至關重要。一般來說，更長的梯度能夠提供更好的色譜分離效果、更小的離子抑制效應以及更少的共洗脫物干擾情況。高度分辨的
MS1 和 MS2 譜圖對于準確的肽段和蛋白質相對定量結果的獲取不可或缺。MS2 最大注入時間、AGC、NCE 以及 MS2
隔離窗口等儀器參數的設置都會影響 MS/MS 譜圖的質量和定量結果。因此在保證儀器高采集速率的同時，應當慎重地選擇這些參數。
液相色譜
肽段的化學修飾會影響其疏水性，從而改變其色譜保留行為。TMT-標記樣品的洗脫通常需要更高比例的有機相。表 3 和 4 分別提供了對未標記和標記的細胞裂解液樣品進行色譜分離的推薦梯度，總梯度時間為 2 小時。
表 3. 未標記樣品的 LC 梯度。
時間 | 時長 | 流速 | %B |
0 | N/A | 300 | 2 |
5 | 5 | 300 | 2 |
105 | 100 | 300 | 20 |
125 | 20 | 300 | 32 |
126 | 1 | 300 | 95 |
134 | 8 | 300 | 95 |
表 4. TMT 標記樣品的 LC 梯度。
時間 | 時長 | 流速 | %B |
0 | N/A | 300 | 5 |
3 | 3 | 300 | 5 |
5 | 2 | 300 | 7 |
105 | 100 | 300 | 25 |
125 | 20 | 300 | 60 |
126 | 1 | 300 | 95 |
134 | 8 | 300 | 95 |
隨著樣品復雜度增加，洗脫梯度也應相應地加長（e.g.，4 小時）以保證更好的色譜分離。然而加長洗脫梯度又不可避免地會導致色譜峰變寬以及母離子 S/N 降低。因此應當考慮增加進樣量或是提高最大注入時間的限制。最終用于評價實驗效果的指標應當是可定量肽段的數量，而所謂可定量肽段是指碎片譜圖包含所有預測報告離子峰的那些肽段。如圖 14 A 中所示，對于 1 μg 進樣量，將洗脫梯度的時間從 2 小時增加到 4 小時，鑒定出的肽段數量從 3,241 個增加到了 3,810 個。鑒定結果顯然受益于分離效果的改善，因為對低豐度肽段的檢測靈敏度增加使得蛋白序列覆蓋率也相應地提高了。另一方面，可定量肽段數并沒有增加，因為最大注入時間設置與 2 小時的梯度相同（表 2）。如果在加長洗脫梯度的同時將進樣量增加到 2 μg，則增加了 400 多條可定量肽段，將肽段的可定量數/可鑒定數所占比例提高到了 85%。同樣地，可定量蛋白質組數也隨著色譜梯度時間和進樣量的共同增加而增加（圖 14B）。這一結果說明，對于高動態范圍的樣品（20:1），實現色譜分離條件、進樣量和最大注入時間的最佳匹配才能取得可靠的定量分析結果。