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  • 發布時間:2019-07-29 20:11 原文鏈接: RACEPCR簡介

    近年來隨著生物技術的不斷發展,出現了許多克隆新基因的方法和手段,如圖譜克隆技術、轉座子標簽技術、mRNA差異顯示技術二基因組減法技術以及cDNA文庫篩選技術等。但上述方法人多具有實驗周期長、技術步驟煩瑣且工作量大等特點。cDNA末端快速擴增技術(rapid amplification of cDNA ends, RACE)是一種基于PCR從低豐度的轉錄本中快速擴增cDNA的5'和3’末端的有效方法,以其簡單、快速、廉價等優勢而受到越來越多的重視。
    經典的RACE技術是由Frohman等(1988)發明的一項技術,主要通過RT-PCR技術由已知部分cDNA序列來得到完整的cDNA5’和3’端,包括單邊PCR和錨定PCR。該技術提出以來經過不斷發展和完善,克服了早期技術步驟多、時間長、特異性差的缺點(Frohman等,1995:Schaefer,l995: Chen,1998: Bespalova等,1998: Matz等11999)。對傳統RACE技術的改進主要是引物設計及RT-PCR技術的改進:改進之一是利用鎖定引物((lock docking primer)合成第一鏈cDNA,即在oligo(dT)引物的3'端引入兩個簡并的核苷酸【5'-Oligo(dT)16_30MN-3', M=A/G/C;N=A/G/C/T】,使引物定位在poly(A)尾的起始點,從而消除了在合成第一條cDNA鏈時oligo(dT)與poly(A)尾的任何部位的結合所帶來的影響;改進之二是在5‘端加尾時,采用poly(C),而不是poly(A);改進之三是采用RNase H一莫洛尼氏鼠白血.病毒(MMLV)反轉錄酶或選擇嗜熱DNA聚合酶可能在高溫h (60 度 -70度 )有效地逆轉錄mRNA,從而消除了5‘端由于高CC含量導致的mRNA 二級結構對逆轉錄的影響;改進之四是采用熱啟動PCR (hot start PCR)技術和降落PCR(touch down PCR)提高PCR反應的特異性。 
    隨著RACE技術日益完善,目前己有商業化RACE技術產品推出,如CLONTECH的MarathoTM技術和SMART TM RACE技術術。邢桂春等(2001)先后使用上述兩種試劑盒進行RACE反應,結果發現使用Marathon TM所得到的片斷總是比采用SMARTsup]TMRACE試劑盒到所得到的片斷短。其原因在于Marathon TM技術反轉錄反應往往不能真正達到mRNA的5’末端。所以認為,進行RACE反應應當優選SMARTTM RACE試劑盒。以下就國內目前應用最廣的SMART TM RACE試劑盒為例,簡要概述RACE技術的原理和操作過程。 SMARTTM 3‘-RACE的原理是:利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作為一個引物結合位點,以連有SMART寡核營酸序列通用接頭引物的Oligo(dT)30MN作為鎖定引物反轉錄合成標準第一鏈cDNA。然后用一個基因特異引物GSP1(gene specific primer,GSP)作為上游引物,用一個含有部分接頭序列的通用引物UPM(universal primer,UPM)作為下游引物,以cDNA第一鏈為模板,進行PCR循環,把目的基因3‘末端的DNA片段擴增出來。

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