RAPD分析的原理及操作技術

1 目的

分子標記是一類建立在分子水平上的遺傳標記，它同樣具有遺傳標記的兩個特點，即可遺傳性和可識別性。廣義的分子標記包括同工酶和DNA分子標記兩類，狹義的分子標記則僅指后者。DNA分子標記通常是一些小分子量的DNA片段（幾十到2000bp左右），它們大量存在于真核生物的基因組內，能夠通過特定的技術和方法進行檢測。多數情況下，這些DNA片段（即分子標記）本身并不是基因，也不是基因的一個部分，但它們往往與目的基因（目的性狀）有連鎖關系。利用這種連鎖關系（越緊密越好），就可以對目的基因進行識別和分離、對目的性狀進行早期預選、對優良基因進行聚合，從而大大促進園藝植物的育種工作。DNA分子標記的種類很多，常用的有RAPD（隨機擴增多態性DNA）、RFLP（限制性片段長度多態性）、AFLP（擴增片段長度多態性）、SSR（簡單序列重復）等，本實驗主要介紹RAPD分析的實驗方法，通過實驗了解RAPD分析的基本原理，認識和掌握RAPD分析在園藝育種中的應用及實驗操作技術。

2 原理

雖然DNA的基本單元是一個個的單核苷酸，但在只含有模板和單核苷酸（dNTP）的反應體系中，DNA聚合酶（Taq酶）并不能啟動聚會反應，這是因為該酶催化的反應是一種延伸反應，即只能在已有的DNA鏈的3’-OH端摻入單核苷酸，形成磷酸二酯鍵，合成方向為5’→3’。因此，還需要在反應體系中提供特定的DNA短鏈（稱為引物），用以啟動DNA的聚合反應。
常規的PCR擴增過程為：① 將反應體系（模板DNA、引物1、引物2、Mg2+、4種dNTP和Taq DNA聚合酶，引物1和2都是特異合成的長度為15－30核苷酸的單鏈DNA）置于高溫（94℃）下變性，使模板雙鏈DNA解鏈為兩條單鏈；② 在低溫（50－60℃）下退火，使引物與模板鏈3’端互補區結合形成部分雙鏈DNA；③ 在中溫（72℃）下延伸，Taq DNA聚合酶根據模板的核苷酸順序，將單核苷酸從引物的3’端順次摻入，催化磷酸二酯鍵生成，實現新鏈的延伸。經過如此的變性、退火和延伸三步構成的一個循環，可使兩種引物限定范圍內的DNA序列擴增一倍。由于每次循環的產物都能成為下一循環的模板，因而PCR產物量以指數方式增加，從理論上計算，經過 22個循環，目的DNA片段可被擴增到106級。

RAPD（Randomly Amplified Polymorphic DNA）是一種建立在PCR技術基礎上、可對整個基因組進行選擇性擴增的分子標記技術。它是以一個隨機合成的10寡核苷酸為引物，在未知序列的基因組 DNA上，對部分DNA序列進行隨機擴增，產生長度不同的DNA產物，通過電泳分離和EB（溴化乙錠，有劇毒）染色，顯示出擴增的DNA條帶。一般來講，只有當模板DNA鏈上不太長（≤2000bp）的區域內，存在2個與隨機引物反向互補（基本或完全互補）的序列，這一段DNA片段才能被擴增，其數量也是以指數方式遞增。RAPD與常規PCR的不同之處是：① 所用的引物比較短，為隨機合成的10寡核苷酸單鏈；② 擴增反應中只用一個引物，但實際起到兩個引物的作用；③ 擴增循環中所用的退火溫度較低（35－40℃），以利于多態性（多個片段）的檢出。
由于DNA聚合酶（Taq酶）的聚合能力和瓊脂糖凝膠的分辨能力的限制，RAPD片段的最佳長度一般為400～2000bp左右。

3 實驗材料

通過實驗一制備得到的質量合格、濃度準確（5μg/μL）的園藝植物基因組DNA溶液，建議編為1號，老師另外提供4個DNA樣品，即YY2（元陽二號荔枝）、YYJ（元陽焦核荔枝）、HZM（雙季龍眼）和ZSG（四季龍眼），建議編為2～5號。

4 主要儀器設備（斜體示必須設備）和實驗用具
PCR擴增儀(Pekin Elmer公司)，高速冷凍離心機(Beckman公司)，低溫高速離心機（Eppendorf公司），DU-640紫外分光光度計(Beckman公司)，電泳系統(BIO-RAD公司)， 凝膠成象系統(BIO-RAD公司)。 移液槍，滅菌的PCR管、離心管、吸頭等。

5 主要試劑

滅菌的ddH2O；10×buffer緩沖液（不含MgCl2）；25mM MgCl2溶液；dNTP（每種2.5mM）；
隨機引物經準確定量后，取少量用ddH2O稀釋成5μM溶液，-20℃下保存備用；
模板DNA經準確定量后，取少量用ddH2O稀釋成5ng/μL溶液，4℃下保存備用；
Taq酶液（2-5 U/μL）；TBE電泳緩沖液；載樣緩沖液（6×或10×）；
瓊脂糖（BIOWEST）；EB染液。

6 實驗步驟

（1） 每5人為一組，每人取5個0.2ml的PCR管，按順序寫上編號。
（2） 配制RAPD擴增的反應液，各組份的用量及終濃度如下表：

如果是做多個反應，可將所用的相同組份一次取樣、混合后再分裝至各個反應中。本實驗中，每組用1種引物，每人做5種模板，每組共做25個反應。操作時，需另取1個1.5ml的PCR管配制混合液，然后分裝到25個管中，每管分裝量為22μL（由一位同學操作）。注意：模板DNA不與其它組份混合，需預先加到5個管中。

（3） RAPD擴增：配制好反應液后 ，放入PCR儀中進行擴增反應，擴增程序為：94℃ 5′（預變性）；94℃ 40″→38℃ 1′→72℃ 1′（40個循環）；72℃ 10′（后延伸）。

（4） 制備1.5％的瓊脂糖凝膠：稱取適量瓊脂糖、量取適量TBE電泳緩沖液，混合后于微波爐中加熱至溶化，補充蒸發的水分，制備得到濃度準確的瓊脂糖凝膠，適當冷卻后小心倒膠，待凝膠板完全冷卻后，小心拔去梳子，將膠板放入電泳槽中，加電泳液淹沒膠面。本實驗中，需制作3-4塊300ml的瓊脂糖凝膠。

（5） 電泳、染色及觀察：
在每個反應產物中，加入適量的載樣緩沖液，混合均勻，得到混合物；
于每個梳孔中，點加適量的混合物（10-20 μL），每排梳孔中最左邊的梳孔用于點加DNA Marker（分子量標記物），以便計算分子量；
以2～3V/cm的電壓進行恒壓電泳，待溴酚藍條帶泳動至凝膠底端時停止電泳；
將凝膠沒入EB染液中染色1～2h，用自來水沖洗后于凝膠成像系統上掃描成像和保存，供進一步的分析之用