實驗概要
DNA分子水平上的多態性檢測技術是進行基因組研究的基礎。RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限制片段長度多態性)已被廣泛用于基因組遺傳圖譜構建、基因定位以及生物進化和分類的研究。RFLP是根據不同品種（個體）基因組的限制性內切酶的酶切位點堿基發生突變，或酶切位點之間發生了堿基的插入、缺失，導致酶切片段大小發生了變化，這種變化可以通過特定探針雜交進行檢測，從而可比較不同品種（個體）的DNA水平的差異（即多態性），多個探針的比較可以確立生物的進化和分類關系。所用的探針為來源于同種或不同種基因組DNA的克隆，位于染色體的不同位點，從而可以作為一種分子標記(Mark)，構建分子圖譜。當某個性狀（基因）與某個（些）分子標記協同分離時，表明這個性狀（基因）與分子標記連鎖。分子標記與性狀之間交換值的大小，即表示目標基因與分子標記之間的距離，從而可將基因定位于分子圖譜上。分子標記克隆在質粒上，可以繁殖及保存。不同限制性內切酶切割基因組DNA后，所切的片段類型不一樣，因此，限制性內切酶與分子標記組成不同組合進行研究。常用的限制性內切酶一般是HindⅢ，amHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子標記則有幾個甚至上千個。分子標記越多，則所構建的圖譜就越飽和。構建飽和圖譜是RFLP研究的主要目標之一。
主要試劑
1、限制性內切酶(BamHⅠ, EcoRⅠ, HindⅢ, XbaⅠ)及10×酶切緩沖液。
2、5×TBE電泳緩沖液：配方見第一章。
3、變性液：0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl 。
4、中和液：1mol/LTris·Cl, pH7.5/1.5mol/L NaCl 。
5、10×SSC：配方見第九章。
6、0.4mol/L NaOH，0.2mol/L Tris·Cl, pH7.5/2×SSC ，ddH2O，Agarose 0.8%， 0.25mol/L HCl 。
實驗步驟
（一）Marker DNA ( λ/Hind Ⅲ)標記
1. 取2ul (1-10ng) marker DNA 于1.5ml離心管中, 再加入13ul水, 在沸水中煮7分鐘。取出后，迅速放于冰浴中, 數分鐘后離心。
2. 在上述離心管中依次加5ul 寡聚核苷酸(olb)、2ul 牛血清蛋白(BSA)和2ulKlenow酶。
3. 加2.5ul P32(dCTP)后，置室溫中5hrs或37℃溫箱中1-2hrs進行標記。
4. 標記完成后，加1 X TE 至500ul。
（二）探針標記
標記探針時，每1－2張膜的探針DNA用量為25ng 。標記方法同上，但最后不用1′ TE稀釋至500ul。
（三）洗膜(Stripping)
已用過的雜交膜，再做雜交前需要洗去原雜交探針, 方法如下：
1. 洗膜液的配制：于40ml熱水中分別加入10ml 20′ SSC和50ml 20％SDS，定溶至2000ml(0.1′ SSC, 0.5%SDS)。
2. 洗膜：將約1－2升（視膜多少而定）洗膜液加熱至沸騰，雜交膜放人洗膜液中，在大于95 ℃條件下洗5分鐘。按同樣方法，重復洗3次。
3. 2′ SSC漂洗：將洗好的雜交膜放人2′ SSC 中漂洗幾分鐘后，用濾紙將雜交膜吸干，保鮮膜包好后置于-20℃或4℃冰箱中備用。
（四）預雜交：
1、預雜交液的配制：于50ml大離心管中分別加入水(6)、5′ HSB(2)、 Denhardt?s(1)Ⅲ, 混勻后置65℃ 水浴中。各種溶液用量視雜交膜的多少而定。(見下表）
預雜交液的配制及用量
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1-2膜 3-6膜 7-10膜
ddH20 6 12 18
5′ HSB 2 4 6
Denhardt 1 2 3
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2、carrier DNA(鮭精DNA)變性：將盛有carrier DNA 的離心管放入沸水中煮7分鐘，變性后迅速放于冰浴中。
3. 待50ml大離心管中的預雜交液澄清后, 加入300ul（9ml預雜交液）、 600ul(18ml）、900ul（27ml）變性后的carrier DNA,混勻后倒人雜交盒中。
4. 將雜交膜放人雜交盒中，并使預雜交液浸勻雜交膜。封好雜交盒后置65℃溫箱中振蕩5－6小時（新膜）或2小時（舊膜）。
(五) 雜交
1. 將標記好的探針用1′ TE 稀釋至50ul。
2. 探針變性：加入5ul(1/10 體積)3 N NaOH變性5分鐘。
3. 雜交：將預雜交后的雜交膜從雜交盒中取出，將適量的標記好的marker DNA(λ－/HindⅡ)和變性好的探針加入預雜交液中混勻。然后將雜交膜放入雜交液中浸勻。封好雜交盒后，置65℃溫箱中振蕩過夜。
(六). 洗脫：
1. Ⅰ型洗脫液配制及洗脫：
洗脫液I： 2′ SSC, 0.5% SDS
洗脫液II：0.2′ SSC, 0.5% SDS
分別取200ml 20′ SSC 和50ml 20％SDS于1000ml 量筒中，取1000－2000ml 加熱至65℃，小心將膜轉入洗脫盒中，并加入少量洗脫液漂洗，然后倒入全部洗液，65℃振蕩洗脫15分鐘。然后再洗第二次，方法同上。若膜較多，應將膜上下翻動。
2. Ⅱ型洗脫液洗脫：用65℃1000－2000mlⅡ型洗脫液洗脫兩次，方法同上。
3. 包膜：用濾紙將膜吸干，然后用保鮮膜包好，（注意：除去氣泡）
(七) 放射自顯影
將洗脫好的雜交膜置于增感屏上, 于暗室中將 X-光片放于雜交膜上，再放上另一張增感屏，裝人暗袋，并用夾板夾好。置-70℃超低溫冰箱中曝光10天左右。
注意事項
1、絕對防止膠與膜之間有氣泡發生, 加蓋濾時也不應有氣泡發生。
2、有時用一種限制性內切酶不能發現RFLP的差異，這時應該試用另一種酶。