RNA修復模板在植物中實現CRISPR／Cpf1同源重組修復

　　借助 CRISPR/Cas 系統介導的 HDR，實現優異等位基因替換和基因定點插入，進而創制農作物新種質，是農作物基因組編輯研究的熱點和重要課題之一。但目前這一技術的廣泛應用仍十分具有挑戰性，主要原因在于：1）CRISPR/Cas系統引起的基因組靶位點DNA序列雙鏈斷裂（Double-strand breaks, DSBs）主要通過非同源末端連接（Non-homologous end joining, NHEJ）途徑進行修復；2）通過同源重組介導的修復（Homology-directed repair, HDR）途徑修復時，無法高效地將足量的修復模板導入植物細胞。因此，在植物細胞內HDR發生頻率特別低，這在很大程度上阻礙了利用CRISPR/Cas系統對農作物基因進行精確編輯。此前，有研究表明，在酵母細胞和人的細胞系中，RNA修復模板可介導HDR (Storici et al., Nature, 2007, 447: 338-341； Nowacki et al., Nature, 2008, 451: 153-158； Keskin et al., Nature, 2014, 515: 436-439)。但RNA轉錄本做為DNA修復模板，用于基因編輯，在植物中實現等位基因精準替換，尚未見國內外相關報道。若在植物中將RNA轉錄本作為DNA修復模板，則可通過利用合適的啟動子，通過體內轉錄，產生足夠多的修復模板，有望解決修復模板不足的問題。

　　2019年3月18日，中國農業科學院作物科學研究所夏蘭琴課題組與美國加州大學圣地亞哥分校和趙云德課題組合作,在Nature Biotechnology雜志在線發表了題為 Precise gene replacement in rice by RNA transcript-templated homologous recombination 的研究論文。該研究證實了在植物細胞中，RNA轉錄本可作為修復模板介導DNA同源重組修復；然后利用轉錄本RNA作為修復模板，借助于核酶（Ribozyme）自切割和 CRISPR/Cpf1 系統既切割DNA又切割RNA的特性，通過同源重組修復方式，實現了水稻乙酰乳酸合成酶（OsALS）的等位基因替換，建立了RNA轉錄本作為修復模板介導的DNA同源重組修復體系。

　　該研究首先將修復模板體外轉錄后，分別進行 DNase I、 RNase H 和 RNase A 處理，然后在體外將LbCpf1蛋白與轉錄的 crRNAs 及RNA修復模板組裝為RNP復合體(Ribonucleoprotein Complex, RNP)。基因槍轉化水稻愈傷后，通過微滴數字PCR (Digital Droplet PCR, ddPCR) 對重組事件進行評估。實驗結果表明，RNA 可作為修復模板參與 CRISPR/Cpf1 介導的DNA同源重組修復。

　　此后，采用兩種方法構建同源重組載體：RDR 和 TDT。在 RDR 方法中，將 crRNA 和修復模板片段（Donor repair template, DRT）置于 HH 及 HDV 核酶之間，分別稱之為RCR (Ribozyme-crRNA-Ribozyme, RCR)和RDR (Ribozyme-DRT-Ribozyme, RDR) 單元。將RCR1、RCR2和RDR置于OsU3啟動子與Nos終止子之間，在轉錄產物中，由于HH及HDV核酶的自切割作用，crRNAs和修復模板被完整釋放。在TDT方法中，修復模板兩側分別加上靶點序列，稱之為TDT (Target-DRT-Target)。將RCR1、RCR2和TDT置于OsU3啟動子與Nos終止子之間，Cpf1可對轉錄產物中TDT兩側的靶點序列進行切割，從而釋放RNA修復模板。通過基因槍轉化水稻愈傷，RDR及TDT載體均獲得ALS基因精確修飾的水稻植株，其中RDR載體效率約為1.7%，TDT載體效率為4.6%。此外，通過水稻農桿菌轉化法，利用TDT載體，也獲得了OsALS基因部分同源重組的水稻植株。后代遺傳分析結果表明，替換后的OsALS基因后代遺傳符合孟德爾遺傳定律。

　　該研究為通過基因編輯實現重要農藝性狀等位基因替換和精準編輯，定向創制農作物新種質，進而加速育種進程，提供了新方法和新思路。

　　中國農科院作科所博士研究生李少雅為本文第一作者，作科所夏蘭琴研究員和美國加州大學圣地亞哥分校趙云德教授為本文的共同通訊作者。

　　專家點評

　　王克劍 研究員 （中國水稻研究所）

　　自2012年CRISPR/Cas基因組編輯技術被發明以來，已被廣泛應用于動物、植物和微生物等諸多物種的基因組編輯。基因組編輯首先在基因組靶向位置產生DNA雙鏈斷裂（DSB），這些產生的DSB可通過非同源末端連接（NHEJ）或者同源重組（HDR）途徑進行修復。NHEJ最常用于移碼突變破壞基因功能，而HDR主要被用于對靶標序列的精準替換或定點插入。在多數物種中，NHEJ是DSB最主要的修復途徑，而通過HDR途徑進行精準修復的概率極低。HDR修復途徑需要額外提供同源重組的供體作為修復的模板，在動物中可以較容易地將CRISPR/Cas系統及同源重組供體遞送入細胞中，而在植物中，主要通過農桿菌侵染或基因槍轟擊愈傷的方式來進行CRISPR/Cas系統以及DNA供體的遞送。雖然利用基因槍轉化或者雙生病毒系統可以增加DNA模板數量進而提高HDR的發生概率，但是實現高效率的植物同源重組依然是一個巨大的挑戰，限制了基因組編輯的拓展應用。

　　夏蘭琴課題組和趙云德課題組合作，設計將RNA作為同源重組修復的模板。與通常使用的DNA模板不同，RNA模板可以在體內通過植物自身的轉錄系統產生，為同源重組修復持續提供更多的穩定模板。研究人員同時選擇具有RNA/DNA雙重切割能力的CRISPR/Cpf1基因編輯系統，在細胞核內同時加工產生用于靶向目標序列的crRNA及一起轉錄的模板RNA，既產生了DSB又提供了同源重組修復的RNA模板，成功獲得乙酰乳酸合酶基因 (OsALS)定點替換成功的抗嘧啶羧酸類除草劑水稻植株，且在子代分離得到了定點替換成功且無外源轉基因成分的植株。這項成果首次證明，除了通常使用的DNA模板，RNA同樣可作為植物同源重組修復的模板。該工作開辟了利用植物RNA作為同源供體模板進行同源修復的新的研究方向，是植物基因組編輯領域的重大進展。在此研究基礎上，進一步優化該策略的效率，有望解決目前植物同源重組頻率低下的難題，加速通過基因編輯技術，精準改良農作物重要農藝性狀，進而定向創制農作物新種質的進程。

　　論文鏈接：

　　https://doi.org/10.1038/s41587-019-0065-7