RNA在脊椎動物的胚胎和器官中的整體標本原位

小鼠或雞的胚胎或器官

PBS 冰預冷 PBT： PBS 中加 0.1% (V V) Tween 20  4℃及室溫 4% （m V)高聚甲醛溶于 PBS (4% PFA)  4℃ PBT中溶25%、50%、75%的甲醇（甲醇 PBT) 100%甲醇 PBT中溶6% (V V)過氧化氫（H2O2; Aldrich)(可選）

解剖工具（如剪刀和鑷子） 70%乙醇浸泡 解剖顯微鏡 20 ml咬合蓋（snap-cap)玻璃小瓶 小勺或者刮鏟 用來放置2 ml小離心管的帶有適配器的加熱板旋轉平臺（Rocker platform)

1) 如果有必要的話，在冰冷的PBS溶液中，使用合適的解剖器具在解剖鏡下將小鼠或雞的胚胎切成小塊。完全除去胚胎外膜和胞衣。打開腔。

2) 將樣本轉移到裝有10 ml左右冷的4%多聚甲醛的20 ml咬合蓋玻璃小瓶中。4℃固 定4 h到過夜。

3) 4℃下用PBT洗樣本兩次。即使樣本不做存儲立即使用，也建議進行脫水、水化和漂白步驟（步驟4?8)，這些步驟可以改進組織的浸透性并且增加方法的靈敏度。也可以選擇胚胎直接從步驟8開始操作。

4) 室溫下分別用25%、50%和75%的甲醇/PBT洗樣本，最后用100%甲醇再洗2次 以達到脫水的目的。

5) 室溫下使用甲醇/PBT溶液以相反的步驟洗樣本，最后再用PBT洗2次以水化樣本。

6) 可選步驟：用含有6%雙氧水的PBT溶液室溫下漂白樣本15 min。

7) PBT溶液洗樣本3次。

8) 用溶于PBT中10μg/ml的蛋白酶K室溫下消化樣本15 min。

9) 用新鮮配置溶于PBT中的2 mg/ml甘氨酸洗樣本以終止消化。

10) PBT洗樣本2次。

11) 新鮮配制的0.2%戊二醛/4%多聚甲醛/PBT再在室溫下固定樣本20 min。

12) PBT 洗 3 次。

13) 向玻璃小瓶中加1 ml預熱的預雜交溶液A，然后轉移樣本到2 ml離心管中。

14) 移除溶液然后加2 ml新鮮配置并預熱的預雜交溶液A。蓋上蓋子，放在65℃加熱 板上并確保蓋子不暴開。將加熱器的側面連在旋轉平臺上。65℃預雜交樣本3h。 不管是在步驟14以前還是以后，樣本都可以在預雜交溶液中-20℃保存6個月。

15) 移除預雜交溶液，加入1 ml含有1μg /ml地高辛標記核酸探針的雜交溶液A，70℃雜交過夜

對于3個10. 5天的小鼠胚胎、2個11. 5天小鼠胚胎或者5個17期的雞胚胎來說，1 ml的雜交溶液就足夠了。

16) 接下來用酶探測RNA雜交物

其他試劑：

PBT中溶10μg/ml蛋白酶K，沒有預先消化的 PBT中溶2 mg/ml甘氨酸（Merck) 新鮮配置，PBT中溶4% (m/V)高聚甲醛和0.2% (V/V)戊二醛（EM級，Sigma) 新鮮配制預雜交溶液A，雜交溶液A:在預雜交溶液A中加入終濃度1μg/ml的地高辛標記的核酸探針