RNA的完整性可以通過瓊脂糖變性電泳分析檢測,而含量則通過紫外分光光度計確定。常見的變性電泳有甲醛變性電泳,戊二醛變性電泳等。
甲醛變性電泳檢測RNA完整性
一、材料、試劑和儀器
1 材料: 植物總RNA 5-10μg
2 試劑:
1)加樣運載緩沖液(Loading buffer),50% 甘油,1mmol/L EDTA (pH 8.0),0.25%溴酚藍,25%二甲苯氰FF
2)10×TAE Buffer
3)5×甲醛凝膠電泳緩沖液:,0.1mol/L MOPs (pH7.0),40mmol/L乙酸鈉,5mmol/L DETA(pH8.0)
4)甲醛, 甲酰胺
3 儀器: 電泳裝置,紫外透射觀測儀
二、實驗程序
1 甲醛變性的瓊脂糖(Agarose) 凝膠的配制
在250mL的錐形瓶中準確稱量2g Agarose (Sigama),再加20mL 10×TAE Buffer,144mLDEPC處理過的雙蒸水,微波爐中化膠,待冷卻至50-60℃加EB至終濃度≤0.5μg/mL。在通風櫥中加入36 mL甲醛,放置一段時間以減少甲醛蒸汽。
2 RNA的甲醛變性電泳
1) 樣品制備,RNA總量10μg,5×甲醛凝膠電泳緩沖液4μl,甲醛 3.5μl,甲酰胺10μl,加入無菌離心管中混合,95℃水浴變性2min(或55℃,15min),取出后放入冰中冷卻。
2) 加入2μl無菌的DEPC處理的加樣運載液。(使用加樣運載液的目的有三: 增大樣品密度, 以確保DNA均勻進入樣品孔內; 使樣品呈現顏色, 便于加樣操作; 能明確顯現樣品在電泳膠上的泳動位置. 以 0.5 X TBE作電泳液時, 溴苯酚在瓊脂糖中的泳動速率與長 300 bp 的雙鏈線狀DNA相同 , 而二甲苯氰FF 的泳動速率與長 4kb 的雙鏈線狀DNA相同)
3)將膠板浸沒在1×甲醛凝膠電泳緩沖液中,點樣前5V/cm預跑5min。點
樣后3-4V/cm電泳。
4)電泳結束后(溴苯酚藍遷移到約8cm處),紫外燈下觀察, 照相。
RNA含量和純度的測定
一、材料,試劑和儀器
1 材料: 待檢測的RNA樣品
2 試劑: DEPC-H2O
3 儀器: 紫外分析儀,石英比色杯
二、實驗程序
1.開機設定參數 ,具體操作參照儀器說明 。
2.用DEPC-H2O做空白調零。
3.將RNA樣品按一定的比例稀釋于DEPC-H2O。
4.混勻樣品后在230nm 、260nm、280nm和310nm波長下讀數,還可掃描動態吸收圖譜。
三 結果與分析
1. 完整的RNA的甲醛電泳可明顯地觀察到28S和18S兩條帶(見圖3.1),并且28S大約是18S的兩倍寬。若兩條帶不明顯, 則說明RNA部分降解,可能的原因是污染了RNase, 或操作劇烈。
2. 定量測定DNA或RNA,應選260nm、230nm、 280nm和310nm波長讀數。其中260nm讀數用來估算樣品中核酸濃度,310nm為背景吸收值。1個OD260值相當于40μg/mLRNA。樣品濃度(μg/mL)=[OD260- OD310]×稀釋倍數×40,OD260/OD280的比值用于估計核酸的純度,OD260/OD230估計去鹽的程度。對于RNA純制品,其 OD260/OD280≈2.0,OD260/OD230應大于2。OD260/OD280<2.0可能是蛋白污染所致,可以增加酚抽提;OD260/OD230<2說明去鹽不充分,可能是GIT污染所致,可以再次沉淀和70%乙醇洗滌。