RNA實驗方法附錄

一、RNA抽提注意事項
盡可能無RNA酶的環境下操作，最好有專門場所
耗材的處理：
電泳槽需0.5 M NaOH處理過夜后DEPC水清洗
試管氯仿浸泡處理后DEPC水清洗
槍頭和eppendorf管DEPC水浸泡后滅菌處理
實驗者本身防護：一次性手套，口罩等
啟蓋前震蕩離心管有助于防止氣溶膠形成
正確的操作方式
二、RNA操作常見問題分析

三、確定RNA質量的常用方法
1） 檢測RNA溶液的吸光度
280、320、230、260nm下的吸光度分別代表了核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白等有機物的值。一般的，我們只看OD260/OD280（Ratio，R）。當R>1.82時，說明RNA中蛋白或者其他有機物的污染是可以容忍的，不過要注意，當用Tris作為緩沖液檢測吸光度時，R值可能會大于2（一般應該是<2.2的）。當R<1.8時，溶液中蛋白或者時其他有機物的污染比較明顯，你可以根據自己的需要決定要不要使用這份RNA（不同的實驗對RNA質量的要求不同）。當R>2.2時，說明RNA已經水解成單核酸了。
2） RNA的電泳圖譜
一般的，RNA的電泳都是用變性膠進行的。但如果僅僅是為了檢測RNA的質量，沒有必要進行如此麻煩的實驗，用普通的瓊脂糖膠就可以了。電泳的目的在于檢測28S和18S條帶的完整性和他們的比值，或者是mRNA smear的完整性。一般的，如果28S和18S條帶明亮、清晰、條帶銳利（指條帶的邊緣清晰），并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，我們認為RNA的質量是好。
3） 保溫試驗：確認RNA溶液中有沒有殘留的RNA酶的方法。
按照樣品濃度，從RNA溶液中吸取兩份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的離心管中，用pH7.0的Tris緩沖液補充到10μl的總體積，然后密閉管蓋。把其中一份放入70℃的恒溫水浴中，保溫1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。
時間到了之后，取出兩份樣本進行電泳。電泳完成后，比較兩者的電泳條帶。如果兩者的條帶一致或者無明顯差別（當然，它們的條帶也要符合方法2中的條件），則說明RNA溶液中沒有殘留的RNA酶污染，RNA的質量很好。相反的，如果70℃保溫的樣本有明顯的降解，則說明RNA溶液中有RNA酶污染。
四、RNA酶活性的控制
為了獲得高質量的真核細胞mRNA， 必須使用RNA酶抑制劑或采用破碎細胞和滅活RNA酶同步進行的方法，最大限度地降低細胞破碎過程中所釋放的RNA酶的活性。同時，避免偶然引入實驗室內其他潛在的痕量RNA酶也很重要。
實驗過程中，由于操作不慎，外源性RNA酶可以通過下述途徑污染RNA：
（１）玻璃制品、塑料制品和電泳槽： 滅菌的一次性使用的塑料制品基本上無RNA酶，可以不經預處理直接用于制備和貯存RNA。實驗室用的普通玻璃器皿和塑料制品經常有RNA酶法染，使用前必須于180 ℃干烤８小時或更長時間（玻璃器皿）或用氯仿沖洗（塑料制品）。另一種方法是用0.1 ％焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡用于制備RNA的燒杯，試管和其他用品。DEPC是RNA酶的強烈抑制劑，但其作用并不是絕對的（Fedorcsak和Ehrenberg,1966）。灌滿DEPC的玻璃或塑料器皿在37℃放置２小時，然后用滅菌水淋洗數次， 并于100℃干烤15分鐘（Kumar和Lindberg,1972）。在15 lbf/in2(1.034x105Pa)高壓蒸氣滅菌15分鐘。上述處理可以除去器皿上痕量的DEPC，以防DEPC通過羧甲基化作用對RNA的嘌呤堿基進行修飾。
用于RNA電泳的電泳槽應用去污劑洗干凈，再用水沖洗，用乙醇干燥，然后灌滿3％的H2O2溶液，于室溫放置10分鐘，然后用0.1 ％DEPC處理過的水徹底沖洗電泳槽。最好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和電泳槽作上特殊標記，存放在指定地點，為RNA實驗專用。
（２）研究人員造成的污染： RNA酶最主要的潛在污染源是研究人員的手。因此，在準備分離的和分析RNA的材料和溶液時，主有涉及RNA的一切操作過程中，都應戴一次性手套，接觸“胖的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能沾染上RNA酶，因此進行RNA實驗時應勤換手套。盡量不要對著RNA樣品呼氣或說話，以防RNA酶污染。
（３）污染的溶液： 用高壓滅菌的水和RNA研究專用的化學試劑配制溶液，用干烤過的藥匙稱取試劑，將溶液裝入無RNA酶的玻璃器皿。可能的話溶液均應用0.1％DEPC于37℃至少處理12小時，然后于100℃加熱15分鐘或在15lbf/in2(1.034x105Pa)的高壓下蒸氣滅菌15分鐘。
注：DEPC可與胺類迅速發生化學反應，因些不能用來處理含有Tris 一類的緩沖液。可存幾瓶新的未開封的Tris晶體以制備無RNA酶的溶液。
RNA酶的抑制劑：
（１）RNA酶的蛋白質抑制劑：該抑制劑是從人胎盤分離的一種蛋白質，可與多種RNA酶緊密結合形成非共價結合的等摩爾復合物，使RNA酶失活。該蛋白質應置于含5mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）的50％甘油中，貯存于－20℃。抑制劑制品凍融數次后或放置在氧化條件下即應棄之不用，因為上述處理會使蛋白質變性從而釋放出所結合的RNA酶。因此，在使用變性劑裂解哺乳動物細胞提取RNA的初始步聚中不應使用這種蛋白抑制劑。然而采用更溫和的裂解方法時應使用這種抑制劑，并且在后續的所有RNA純化步驟中均應有此蛋白質存在。由于酚抽提可以除蛋白質抑制劑，故應在純化過程中補加幾次抑制劑。其最大活性的發揮要求巰基試劑，而且它并不干擾反轉錄或mRNA在無細胞體系中的翻譯。
（２）氧釩核糖核苷復合物：這種由氧釩（1V）離子和4種核糖核苷之中的任意一種所形成的復合物，是種過渡態類似物，它能與多種RNA酶結合并幾乎能百分之百地抑制RNA酶的活性。這４種氧釩核糖核苷復合物可加入完整細胞中，在RNA提取和純化的所有過程中，其使用濃度都是10mmol/L。所得到的mRNA可直接在硅卵母細胞中進行翻譯， 并能作為某些酶促反應（如mRNA反轉錄）的模板。然而氧釩核糖核苷復合物強烈抑制mRNA在無細胞體系中的翻譯，因此必須用含0.1 ％羥基喹淋的苯酚[ 用0. 01mol/L Tris.Cl(pH7.8)平衡]多次抽提以除之。
（３）Macaloid（硅藻上）：Macaloid是一種粘土，很多年前就發現它能吸附RNA酶，用緩沖液將其制成漿液，以0.015％（W/V）的終濃度溶解細胞。 這種粘土隨同它所吸附的RNA酶可在后續的RNA純化過程中（如酚抽提后）經離心去除。
破碎細胞和滅活RNA酶同步進行的方法：
用強烈變性如鹽酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白質，導致細胞結構破碎，核蛋白由于其二級結構的破壞而從核酸上解離下來。RNA酶可耐受多種處理等，因此可聯用上述試劑，從組織中，如富含RNA酶的胰腺中，提取完整無損的RNA。