RNA干擾載體的構建的實驗流程

• RNA干擾載體主要用來研究基因表達調控，RNA干擾技術已已被廣泛用于基因結構功能研究和傳染性疾病及基因治療領域，進行RNA干擾實驗首先是構建RNA干擾載體，本文以pRI系列載體為例論述了干擾載體的構建的實驗流程。
  
  產品技術背景
  
  pRI系列載體是基于III類rna聚合酶啟動子：人類H1啟動子的專用于哺乳動物細胞RNA干擾的載體。H1啟動子在哺乳動物細胞內合成類似siRNA分子的小分子RNA。由于H1啟動子有精確的轉錄起始位點和終止信號，H1啟動子轉錄產物精確生成人工設計的shRNA，shRNA經過RISC剪切后形成有2個U突出末端的成熟siRNA。由于H1啟動子對轉錄產物長度的嚴格限制，基本上杜絕了非特異性干擾片段的產生，將載體轉染細胞后對其它基因的影響降到最低。

pRI系列載體已經成功用于多種哺乳動物細胞進行基因的RNA干擾。本系列中含有新霉素抗性基因的載體用于穩定表達siRNA，可以在更長時間內對基因表達抑制后的細胞功能和生理現象進行觀察和分析。

插入寡核苷酸設計

pRI系列載體的使用需要將人工設計的寡核苷酸片段插入pRI系列載體中特定的酶切位點之間，寡核苷酸片段中包含了針對目標基因的mRNA設計的長度為19nt的干擾片段。

合成時需要化學合成正向和反向兩條寡核苷酸。正、反向寡核苷酸退火后與載體連接，插入載體XhoI，BglII位點之間，位于載體上H1啟動子下游正確的位置上。連接后的載體轉入哺乳動物細胞在H1啟動子作用下轉錄產生shRNA。

1. 選擇干擾序列

在RNA干擾實驗中，RNA干擾序列的選擇會顯著影響RNA干擾效果。我們建議您按照以下幾點指導原則選擇RNA干擾序列：

推薦長度為19 nt，采用21 nt序列也可以取得良好效果。

RNA干擾序列中不包含大于3 nt的連續相同堿基。

RNA干擾序列的GC含量為低到中等水平(推薦GC含量在35%到50%之間)。

不要將RNA干擾序列設計在已知的RNA-蛋白質結合位置附近。

確保RNA干擾序列與其它基因沒有較高的同源性。

方向：在編碼mRNA的正義鏈上選擇RNA干擾序列。

設計RNA干擾序列是RNAi實驗的關鍵。這里提供的設計原則可以為您設計RNA干擾序列提供幫助。但是，值得注意的是，遵循這些原則不能確保設計的RNA干擾序列對目標基因有好的抑制效果。針對一個目標基因，我們建議您至少設計3條干擾序列并且從中篩選出干擾效果好的序列。

2. 寡核苷酸設計。

（1）設計正義寡核苷酸鏈(5’-3’方向)。

a) 5’TCGACCC

b) 19nt干擾序列正向序列(與目標mRNA一致)。

c) TTCAAGAGA(環狀結構)。

d) 19nt干擾序列的反向互補序列。

e) TTTTT。

（2）設計反義寡核苷酸鏈(5’-3’方向)。

a) 去掉正義鏈寡核苷酸中5’TCGA

b) 將步驟a)中得到的序列做反向互補。

c) 在步驟b)中得到的序列的5’端加上堿基GATC。

實驗流程

概述：

以下為使用pRI載體的方法概述。

1. 將合成的正義和反義寡核苷酸鏈退火。

2. 用BglII和XhoI雙酶切載體。

3. 將退火的寡核苷酸鏈與酶切后的線性載體連接。

4. 連接產物轉化大腸桿菌。

5. 轉染細胞。

6. 觀測熒光表達(含有GFP的載體)或篩選穩定表達細胞(含有抗性的載體)。

7. 檢測目標基因蛋白或mRNA表達水平

載體構建

對于實驗中的很多步驟，您可以使用您實驗室中常用的方法，或者您的實驗經驗證實有效的方法。對于酶切、DNA純化以及轉化等步驟，您可以參照《分子克隆實驗指南》進行，也可以參照您購買的試劑盒中生產商提供的使用說明進行。

步驟1：退火寡核苷酸鏈

根據我們的經驗，脫鹽純化的寡核苷酸足以滿足連接和克隆需要。但是不同供應商提供的引物純度差別很大，如果您連接和克隆遇到困難，可以考慮換用PAGE純化或HPLC純化的引物，或者使用其他供應商提供的引物。

用水將寡核苷酸稀釋為100 μM。按以下體系配制退火反應體系：

正義寡核苷酸(100 μM) 5 μl

反義寡核苷酸(100 μM) 5 μl

NaCl 100 mM

Tris-Cl pH7.4 50 mM

加水補足 50 μl

將配制好的退火反應緩沖液重復混合，短暫離心后放置PCR以上，運行以下程序：90 ℃ 4 min，70 ℃ 10 min，55 ℃ 10 min，40 ℃ 10 min，25 ℃ 10 min。退火后的寡核苷酸可以立刻使用或者在-20 ℃長期保存。

步驟2：酶切載體

用XhoI和BglII雙酶切2 μg載體。酶切方法和體系參照您購買的內切酶說明書或者按照您的實驗室習慣的方法進行。

通常情況下用大約20-30單位的酶在大約3小時可以酶切完全。

酶切后我們建議用瓊脂糖凝膠回收線性化載體。將回收后的載體體積稀釋為30 μl。

對線性化的載體進行去磷酸化處理是沒有必要的。充分酶切后的載體具有不匹配的末端，一般不會發生載體自連。

步驟3：連接載體

用水將退火后寡核苷酸稀釋100倍備用。按照以下體系配制連接反應體系：

T4 DNA 連接酶 5 U

線性化載體　　　 2 μl

稀釋后寡核苷酸 2 μl

10×連接酶Buffer 1 μl

加水補足 10 μl

接連反應條件和時間參照您購買的連接酶說明書進行。

為了減少空載體自連，連接反應完成后，在連接反應體系中加入1 μl BglII，37 ℃反應30 min，切割連接上的空載體。(選做)

步驟4：轉化大腸桿菌感受態

用連接后產物轉化大腸桿菌感受態細胞。市場上常見的大腸桿菌感受態細胞(例如Top10，DH5-α)均可以使用，您也可以按照分子克隆中的方法自己制備感受態細胞。轉化方法按照供應商的說明書或者您實驗室中常用的方法進行。

在氨芐抗性的瓊脂平板上37 ℃培養轉化后細菌，大約14-16小時后，平板上出現單個細菌菌落。挑取多個菌落至氨芐抗性的培養基中培養后進行鑒定。

鑒定方法可以采用PCR鑒定或酶切鑒定。

PCR鑒定采用引物M13F(TGTAAAACGACGGCCAGT)和M13R-48(AGCGGATAACAATTTCACACAGGA)進行鑒定，空載體擴增產物長度為308 bp，陽性克隆擴增產物為361 bp。

酶切鑒定采用HindIII和EcoRI雙酶切。空載體酶切產物長度為235 bp，陽性克隆酶切產物長度為288 bp。

鑒定正確的克隆可以用引物M13R-48測序驗證插入的寡核苷酸序列是否正確無誤。

步驟5：轉染細胞

pRI系列載體可用常用的轉染方法進行細胞轉染。包括：磷酸鈣轉染、脂質體轉染、電穿孔轉染等。您可以購買市售的商品化轉染試劑并且參照供應商說明書進行細胞轉染實驗。

步驟6：觀測GFP熒光和穩定表達細胞系篩選

如果細胞轉染成功，并且您使用了帶GFP的載體，根據細胞生長速度的不同，在轉染后3-5天能在熒光顯微鏡下觀察到細胞發出綠色熒光。請注意，綠色熒光蛋白的表達表明轉染細胞成功，不能說明RNA干擾實驗成功。

如果您使用了帶有真核抗性標簽如Neo-R的載體，這時您可以加入合適濃度的相應藥物如G418進行穩定表達細胞株的篩選。

步驟7：檢測RNA干擾效率

您可以在蛋白水平或mRNA水平檢測RNA干擾效率。一般情況下蛋白的表達變化與mRNA水平的表達變化一致， 也有少數情況下mRNA表達水平變化不及蛋白表達下降明顯。

為檢測蛋白表達情況，您可以使用Western-Blot。

為檢測mRNA表達情況，您可以使用逆轉錄+Realtime PCR或Northern-Blot。

具體檢測方法請參照分子克隆使用指南或者您實驗室的常用實驗方法。

疑難問題

遇見RNA干擾效果不理想，可以參考以下問題：

1. 寡核苷酸合成設計錯誤的核苷酸較多，致使序列與設計不符。建議做轉染之前對載體進行驗證，可以通過酶切以及測序進行測試。

2. 如果細胞轉染效率不高，建議加入GFP進行標記檢測。