RNA抽提和標記實驗

從組織培養收獲的細胞在組織培養中的細胞凍存的整個組織

磷酸鹽緩沖液（PBS）TRIzol 試劑乙醇乙酸鈉EDTANaOHTris-ClTE 緩沖液固定化的 oligo-dT 引物

組織勻漿器熱循環儀熒光掃描儀

實驗所需「材料」、「試劑」、「耗材」具體見「其他」

1a. 若從收獲的組織培養細胞開始：用 PBS 將細胞沉淀洗滌兩次。

1b. 若從組織培養的細胞開始：每 2×10⁷ 細胞加入 1 ml TRIzol 再晃動混勻。

1c. 若從組織開始：每 100 mg 冰凍組織直接加入 4 ml TRIzol，用旋轉刀片式組織勻漿器勻漿。

2. 加入 1/5 體積氯仿，搖振 15 s，靜置 3 min。4℃ 12 000 g 離心 15 min。

3. 將上清輕輕轉移到一個 15 ml 聚丙烯管內，記下體積。

4. 邊混勻邊逐滴加入等體積的 70％ 乙醇（終濃度 35％）。

5. 把從 2×10⁷～1×10⁸ 細胞提取的上清加入一個放在 50 ml 離心管中的 RNeasy Maxi 柱內。

6. 在臨床離心機的水平轉頭上室溫，以 2880 g 離心 5 min。

7. 收集流出液，把它再倒回柱子上部，重復步驟 6 操作一次。

8. 棄去流出液，往柱子里加 15 ml RWl。20～25℃， 2880 g 離心 5 min。

9. 棄去流出液，往柱子里加 10 ml RPE。20～25℃， 2880 g 離心 5 min。

10. 棄去流出液，再次往柱子里加 10 ml RPE。20～25℃，2880 g 離心 10 min。棄去流出液。

11. 將柱子放入一個新的 50 ml 錐形聚丙烯離心管，加入 1 ml DEPC 處理過的水（試劑盒附帶）。靜置 1 min。20～25℃，2880 g 離心 5 min，不要棄去流出液。

12. 再往柱子里加入 1 ml DEPC 處理過的水。放入上面的離心管靜置 1 min。20～25℃，2880 g 離心 10 min。

13. 按 400 ul 每管將洗脫液分裝到 1.5 ml 微量離心管里。

14. 每管加入 1/10 體積的 3 mol/L 乙酸鈉（pH 5.2.）然后加入 1 ml 100％ 乙醇，振蕩混合，室溫靜置 15 min。

15. 4℃，12 000 g 離心15 min。用 75％ 乙醇洗滌沉淀兩次。于 -80℃，在 75％ 乙醇內無限期保存。

16. 4℃，12 000 g 離心 15 min。吸掉上清，空氣中晾干。用 DEPC 處理過的水重溶 RNA 到濃度約 1 mg/ml。取1 ul 加入 100 ul 50 mmol/L NaOH 中讀取 A₂₆₀ 數值， 確定 RNA 濃度。

17. 在 Microcon YM-100 過濾管內以 500 g 離心濃縮到濃度＞7 mg/ml， 如有必要可測定濃縮率。

18. 用分光光度法測定濃縮后 RNA 樣品的濃度。保存于 -80℃。

19a. 若用固定化的 oligo-dT 引物：將引物與 RNA 在下面 17 ul 反應體系里復性（使用 0.2 ml 薄壁 PCR 管，以便溫育過程可以在熱循環儀上進行）：

19b. 若用 oligo-d （T）12-18 引物：將引物與 RNA 在下面 17 反應體系里復性（使用 0.2 ml 薄壁 PCR 管，以便溫育過程可以在熱循環儀上進行）：

20. 65℃ 加熱 10 min，冰上放置 2 min。

21. 準備含有下列組分的母液（總體積 23 ul）：

8 ul 5×第一鏈緩沖液

4 ul 10×低 T 的 dNTP 混合液

4 ul 1 mmol/L Cy5 或 Cy3 標記的 dUTP

4 ul 0.1mol/L DTT

1 ul 30 U/ul RNasin

2 ul 200 U/ ul Superscript II

22.每管樣品加入 23 ul 含有 Cy5-dUTP 或 Cy3-dUTP 的反應混合液。吹吸混勻，快速離心使溶液集中在管底。

23. 42℃ 溫育 30 min， 再次加入 2 ul Superscript II。確保酶在反應體系里充分混勻， 再在 42℃ 溫育 30～60 min。

24. 加入 5 ul 0.5 mol/L 的 EDTA （pH 8.0）終止反應。

25. 加入 10 ul 1mol/L NaOH， 在 65℃ 溫育 60 min 以降解殘余的 RNA。冷卻至室溫。此步驟所用氫氧化鈉的純度至為關鍵。輕微的污染或長期儲存于玻璃容器會造成這種溶液可以降解 Cy5 分子，并使溶液變黃。有些研究者把水解時間減少到 30 min 而得到較好的效果。

26. 加入 25 ul 1 mol/L 的 Tris-Cl （pH 7.5）中和溶液。

27. 將標記的 cDNA 和 400 TE緩沖液（pH 7.5）Microcon YM-100 柱子里，吹吸混勻。室溫 500 片用 10min 以脫鹽。

28. 再次加入 200 ul TE 緩沖液（pH 7.5）洗一次， 到大約 20～30 ul （500 g 約 8～10 min）。

29. 把柱子倒轉放入另一個干凈的收集管，室溫 500 g 離心 3 min 以回收 cDNA。

有些情況下，Cy5 標記的 cDNA 在濃縮管中會形成膠狀的藍色沉淀。看到這種東西意味著有污染。污染越嚴重，cDNA 被膠吸附的比例越高。即使加熱溶解了，這種東西也是傾向于不加識別地與靶 DNA 非特異結合。

30. 取 2～3 ul Cy5 標記的 cDNA 檢測，剩余的 18～28 ul 用作雜交。

31. 用標記的探針跑 2％ 瓊脂糖膠檢測，用 TAE 緩沖液。為了使膠的熒光分析達到最大的靈敏度，跑膠時只加入最少的染料，膠里或緩沖液中都不要加溴化乙錠。

32. 用 Molecular Dynamics 的 Storm 突光掃描儀掃描膠（參數：紅色熒光，20 um 分辨率， 1000V on PMT）。參見圖 1 看典型的標記成功（A 泳道）和失敗（B 泳道）的例子

圖1 Cy5 標記的 cDNA 在 2％ 瓊脂糖電泳后的熒光掃描。

除有特別說明，所有溶液需用無RNA酶的水（如 DEPC 處理過的水）配制。

1. 材料

從組織培養收獲的細胞,在組織培養中的細胞，凍存的整個組織

2. 試劑

磷酸鹽緩沖液（PBS）

TRIzol 試劑（Life Technologies） 氯仿

100％、75％ 和 70％ 乙醇

Rneasy 大規模試劑盒（Qiagen）內含：

50 ml 大規模離心柱和收集管

RW1 緩沖液 RPE 緩沖液

DEPC 處理過的水（試劑盒附帶）

3 mol/L 乙酸鈉，pH 5.2

2 mg/ml 固定化的 oligo-dT 引物（固定的：5’-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTV N－3’；如 Genosys 公司）

1 mg/ml d （T） 12－18 （Amersham Pharmacia Biotech）

10×低 T 的 dNTP 混合液

1 mmol/L Cy 3-dUTP 或 Cy 5-dUTP，保存于 -20℃，對光敏感。

RNasin RNA 酶抑制劑（Promega）

Superscript II 逆轉錄酶試劑盒，無 RNA 酶 H，帶有 5×第一鏈緩沖液和 1 mol/L DTT （Life Technologies）

0.5 mol/L EDTA

1 mol/L NaOH

1 mol/L Tris-Cl， pH 7.5

TE 緩沖液，pH 7.5

1 mg/ml 人 C₀t－1 DNA （Life Technologies）

2％（m/V）瓊脂糖膠（寬 6 cm×長 8.5 cm， 孔寬2 mm）溶于TAE 緩沖液

50×TAE緩沖液

3. 耗材

組織勻漿器（如 Brinkmann Instruments 的 Polytron PT 1200）

15 ml 圓底聚丙烯離心管

50 ml 圓錐聚丙烯離心管

有水平轉頭可離心 50 ml 圓錐離心管的臨床離心機

1.5 ml 微量離心管

離心過濾管（如 Amicon 公司的 Microcon YM－100）

0.2 ml 帶蓋薄壁 PCR 管

熱循環儀

熒光掃描儀（如 Molecular Dynamics 用于凝膠分析的 Storm 系統）