RNA提取與RTPCR(2)

融解RNA一般使用TE。

保存RNA應該盡量低溫。為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品（如胰臟、肝臟）中分離到的 RNA需要貯存在甲醛中以保存高質量的RNA，對于長期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA，在水中貯存一個星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中提取的 RNA，在水中保存3年仍保持穩定。另外，長度大于4kb的轉錄本對于痕量RNase的降解比小轉錄本更敏感。為了增加貯存RNA樣品的穩定性，可以將 RNA溶解在去離子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源于胰臟的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。當準備使用RNA時，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaAc至0.3M，12,000×g離心5分鐘。

1.6RNA抽提新方法 -TRIZOL法

TRIZOL試劑是直接從細胞或組織中提取總RNA的試劑。它在破碎和溶解細胞時能保持RNA的完整性。加入氯仿后離心，樣品分成水樣層和有機層。RNA存在于水樣層中。收集上面的的水樣層后，RNA可以通過異丙醇沉淀來還原。在除去水樣層后，樣品中的DNA和蛋白也能相繼以沉淀的方式還原。乙醇沉淀能析出中間層的DNA，在有機層中加入異丙醇能沉淀出蛋白。共純化DNA對于樣品間標準化RNA的產量十分有用。

TRIZOL 是有毒物，接觸皮膚或者不慎吞服，會導致灼傷，一旦接觸皮膚后立即以大量的洗滌劑和清水清洗。TRIZOL在室溫下能穩定保存12個月。盡管如此，為達到最佳效果，建議保存在2-8°C的環境下。

2.RT-PCR

RT-PCR是指將逆轉錄(Reverse Transcription；RT)反應和PCR (Polymerase Chain Reaction)反應組合在一起的方法。

2.1 RT-PCR的原理

RT-PCR將以RNA為模板的cDNA合成同PCR結合在一起，提供了一種分析基因表達的快速靈敏的方法。RT- PCR用于對表達信息進行檢測或定量。另外，這項技術還可以用來檢測基因表達差異或不必構建cDNA文庫克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護分析、原位雜交及S1核酸酶分析在內的RNA分析技術，更靈敏，更易于操作。

RT-PCR的模板可以為總RNA或poly(A)+選擇性RNA。逆轉錄反應可以使用逆轉錄酶，以隨機引物、oligo(dT) 或基因特異性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在最佳條件下進行。cDNA的合成首先在逆轉錄緩沖液中進行，然后取出1/10的反應產物進行PCR。在一步法RT-PCR中，逆轉錄和PCR在同時為逆轉錄和PCR優化的條件下，在一只管中順次進行。

2.2 RT-PCR的步驟

⑴在冰浴離心管里面加入模板RNA 4uL，引物2uL，去離子水5uL，混勻，離心3-5秒；

⑵70度水浴5分鐘，冰浴30秒（此處是為了使引物和模板正確配對）；

⑶ 加入5×反應液4uL，RNase抑制劑1uL，dNTP 2uL（這些應該先配好，然后分再裝到每一管），混勻；

⑷37度水浴5分鐘，加入1uL AMV-RT反轉錄酶，混勻；

⑸37度水浴1小時（此步是反轉錄過程）；

⑹70度10分鐘結束反應（此處是滅活酶活性，避免對后續實驗產生干擾），產物置冰上進行下一步PCR實驗，余下的-70度保存。