RNA的提取

【實驗原理】
Trizol 試劑是直接從細胞或組織中提取總RNA 的試劑。它在破碎和溶解細胞時能保持RNA 的完整性。加入氯仿后離心，樣品分成水樣層和有機層。RNA存在于水樣層中。收集上面的的水樣層后，RNA 可以通過異丙醇沉淀獲得。
【實驗儀器】
1. 勻漿機
2. 低溫離心機
3. 渦旋器
【試劑及配制】
1. Trizol
2. 三氯甲烷
3. 異丙醇
4. DEPC
5. DEPC 處理水
DEPC 溶解于ddH2O 中使其終濃度位0.1%，37℃處理12 h 或室溫過夜，15 磅濕熱消毒15 min。
6. 75%乙醇（0.1% DEPC 水配制）
【實驗步驟】
1. 標本處理
1） 組織：50-200 mg 組織/ml Trizol，勻漿，室溫放置5 min；
2） 細胞：1 瓶細胞（25cm2）/ml Trizol，緩慢搖動，室溫放置5 min，反復吹吸幾次收集，此時可保存于-70℃。
2. 去蛋白，去DNA
1） 加入0.2 ml 三氯甲烷，用力振搖15 sec；
2） 室溫放置2-3 min；
3） 4℃，12,000 rpm 離心15 min；
4） 轉移上層水相（約0.6 ml）至1.5 ml 離心管中。
3. RNA 沉淀
1） 加入0.5 ml 異丙醇，混勻；
2） 室溫放置10 min；
3） 4℃，12,000 rpm 離心10 min；
4） 棄上清，沉淀以1 ml 75%乙醇洗滌；
5） 4℃，10,000 rpm，離心10 min；
6） 沉淀于室溫晾干（約5-10 min）。
4. 溶解RNA
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1) 以10～50 μl 0.1% DEPC 水溶解，若不馬上使用，以1/10 體積3MNaAc (pH 5.0)，2.5 倍體積無水乙醇沉淀，于-70℃貯存；
2) 定量：取1-3 μl 稀釋至800 μl，測定OD260 及OD280。
D260/OD280=1.8～2.0
1 OD260= 40 μg/ml RNA
【注意事項】
1. 試劑均由0.1% DEPC 水配制。
2. 提取過程中所有材料(tube，tip)均為RNase free。
3. 操作過程中勤換手套，避免RNase 污染。