RNA的提取和cDNA合成（酸苯酚法）

內 容 提 要
利用酸-苯酚法提取植物葉片中的RNA，并對其進行純化，最后利用反轉錄酶得到相應的cDNA，可用于以后的分子生物學操作。
本實驗要求：
1、掌握酸-苯酚法提取RNA的方法。
2、了解RNA操作中的重要性。
原 理
從真核生物的組織或細胞中提取mRNA,通過酶促反應逆轉錄合成cDNA 的第一鏈和第二鏈，將雙鏈cDNA 和載體連接,然后轉化擴增，即可獲得cDNA 文庫,構建的cDNA 文庫可用于真核生物基因的結構、表達和調控的分析；比較cDNA 和相應基因組DNA 序列差異可確定內含子存在和了解轉錄后加工等一系列問題。總之cDNA的合成和克隆已成為當今真核分子生物學的基本手段。
一、主要儀器、材料、和試劑
1. 儀器
恒溫搖床，臺式高速離心機，恒溫水浴鍋，瓊脂糖凝膠電泳裝置，生化培養箱，電泳儀，超凈工作臺，移液器。

2. 材料
植物葉片
3. 試劑
⑴ RNA提取液儲液：
25g異硫氰酸胍，29.3mL滅菌重蒸水，1.76mL0.75M檸檬酸三鈉，于65℃溶解后，加入2.64mL 10% Sarcosyl（10% Lauroyl sarcosin：在65℃下，用90mL的滅菌重蒸水溶解10g Sarcosyl，pH 6.7）
⑵ RNA提取液：10mL 提取液儲液+72mL b-巰基乙醇，現用現配。
⑶ AMV第一鏈cDNA合成試劑盒購自上海生工。
二、操作步驟
1．葉片總RNA的提取和純化
根據Chomeyrshi，Sacchi和Logemann ( 1987 )的酸-苯酚法略作修改。
① 將200-400毫克處理的半葉狀體轉移到經液氮預冷凍的研缽中，加液氮充分研磨，再加入2mL提取液（提取液成分見后），然后轉移至7mL離心管中，并加入200mL 2 M的醋酸鈉（pH4.0）, 振蕩混勻；
② 加入2mL水飽和酚（含0.1% 8-羥基喹啉）和400mL氯仿：異戊醇（V:V = 49:1）, 振蕩抽提，冰浴20－30分鐘；
③ 18,000g在4℃下離心20分鐘，取上清液，加入等體積的異丙醇，-18℃放置1小時以上；
④ 在4℃下18,000g離心20分鐘，棄上清，用3M醋酸鈉（pH5.2, DEPC-H2O配制），輕洗沉淀，然后在室溫下以18,000g離心6分鐘, 棄上清；
⑤ 重復步驟（4）一到兩次;
⑥ 用75%乙醇（DEPC-H2O配制）洗沉淀，室溫下以18,000g離心6分鐘，徹底揮發除去乙醇;
⑦ 用30-50mL DEPC-H2O溶解核酸沉淀，得到初步提純的RNA樣品。測出核酸樣品在280nm、260nm、230nm的光吸收值，計算A260nm/A280nm、A260/A230nm的值，以分析所提核酸樣品的質量和濃度。
2. RNA樣品中DNA的去除，用DNase I來消化，反應體系及程序如下：
①100mL反應體系中含有；
1 mg/mL RNA sample 60 mL
DEPC-H2O 28 mL
10′Buffer 10 mL
DNase I (5u/mL) 2 mL
混勻以后，37℃溫育30分鐘
② 加入80mL水飽和酚和25mL氯仿，充分振蕩，冰浴15分鐘;
③ 在室溫下以20,000 g離心6分鐘，取出上相（水相），加入1/9體積的3M醋酸鈉（pH 5.2）, 混勻后，再加入2倍體積的冷無水乙醇，-18℃下放置2小時以上;
④ 20,000 g離心9分鐘，棄上清，用75% 乙醇輕洗沉淀，并在真空中徹底揮發除去乙醇;
⑤ 把得到的RNA樣品溶于適量的DEPC-H2O中，測樣品的OD值，計算出所提RNA樣品的總量和濃度。
3. cDNA的合成

① 在200μL 薄壁PCR 管中依次加入相應的如下試劑

② 混勻后，65℃溫育5 分鐘, 迅速冰浴5 分鐘；RNA（1μg/μL） 2μL

③ 再依次加入

④ 混勻后，37℃溫育10min； RNase Inhibitor（40U/μL） 1μL

⑤ 再加入AMV Reverse Transcriptase，2μL，混勻，終體系為20μL； （6） 42℃反應1h；

⑦ 99℃煮沸5 分鐘，冰浴3min 。