RNA的斑點雜交

實驗概要

本實驗介紹了RNA的斑點雜交操作流程及注意事項。

主要試劑

1. 預雜交液：5×SSC，2×Denhardt液(或采用試劑盒的相應試劑)，0.02%(W/V) SDS

2. 雜交液DIG Easy Hyb

3. 含0.1%SDS 2×SSC和含0.1%SDS 0.1×SSC

主要設備

雜交袋

實驗步驟

1. 預雜交

   1) 先將預雜交液熱至60℃；

   2) 將帶有目的RNA的硝酸纖維素膜放入稍寬于濾膜的雜交袋，加入預雜交液，按每2500px²濾膜加20ml；

   3) 盡可能除凈袋中的空氣，用熱封口器封住袋口，將其置60℃水浴過夜，其間不斷翻動塑料袋。

2. 雜交

   1) 雜交液DIG Easy Hyb(20ml/2500px²)預溫輕振蕩30min；將標記探針DNA(5～25ng/ml)煮沸變性5min，迅速置冰水中冷卻；

   2) 加入到預溫的D1G Easy Hyb(2.5ml/2500px²)中混合，避免形成氣泡；

   3) 探針/D1G Easy Hyb注入雜交袋中，封好雜交袋；

   4) 68℃振蕩孵育至少6h，在微量DNA時建議16h，使其雜交；

   5) 2×SSC，0.1%SDS清洗2次，每次5min室溫；

   6) 68℃振蕩條件下，0.1×SSC，0.1%SDS清洗2次，每次15min。

注意事項

1. 中和：尤其是計劃使用硝纖膜時，凝膠中和后需查一下pH值，pH值應小于9.0，否則會導致膜變黃和破壞。尼龍膜可以承受更高的pH值。

2. 轉移：最好選用尼龍膜(帶正電荷)。處理膜時絕對小心，不能將指痕印在膜上，只能用無齒鑷夾邊角位置。

3. 固定：轉膜后的DNA必須固定才能用于雜交。方法有二，其一是紫外光照射；其二是120℃烘烤30分鐘(尼龍膜)或180℃真空烘烤2小時(硝纖膜)。相比之下，照射更為簡便。

4. 標記和雜交的各種溶液應高壓滅菌；含SDS，Tween20的溶液應經濾膜除菌后加入其它溶液；使用滅菌吸頭，干凈器皿，每次用前必須嚴格清洗。操作膜時戴無塵手套；只用無齒鑷操作膜的邊緣。

5. 探針濃度探針濃度是非常重要的因素，應予高度重視。濃度過高會增加背景，濃度過低又會導致敏感性下降。應通過模擬雜交試驗來確定最佳濃度。

6. 可用β-actin作為內參考對照。

7. 整個RNA實驗中，要防止激活內源性RNase。