實驗材料 [α32P]UTP 或 CTP(800Ci ml10mCi ml) UTP 或 CTP T4 多核苷酸激酶(γ32P)ATP 牛小腸磷酸酶T4RNA 連接酶 [32P]pCpATP2Oumol L 無 tRNA 酶的牛血清白蛋白
試劑、試劑盒 10XT4 多核苷酸激酶緩沖液 DEPC 處理的水 10X 磷酸酶緩沖液 TE(pH7.4) 5mol LNaCl TE(pH7.6) 10XT4RNA 連接酶緩沖液 DMSO
實驗步驟
一材料與設備
1)[α32P]UTP 或 CTP(800Ci/ml,10mCi/ml)。
2)UTP 或 CTP。
3)T4 多核苷酸激酶
4)10XT4 多核苷酸激酶緩沖液
5)(γ32P)ATP(3000Ci/mmol；10mCi/ml)
6) 牛小腸磷酸酶
7)DEPC 處理的水
8)10X 磷酸酶緩沖液
9)TE(pH7.4)
10)5mol/LNaCl
11)TE(pH7.6)
12)T4RNA 連接酶
13)[32P]pCp(3000Ci/mmol；lOmCi/ml)
14)10XT4RNA 連接酶緩沖液
15)DMSO
16)ATP，20umol/L。
17 無 tRNA 酶的牛血清白蛋白
二、操作方法
(一）RNA 內部標記
1) 在體外轉錄體系中加入 5ul[α32P]UTP 或 CTP(800Ci/ml，10mci/ml），不加未標記的 UTP 或 CTP 或限制它們的濃度為 10?15umol/L, 孵育時間最長為 1 h
2)DNase 消化后，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 RNA, 純化標記的全長 RNA。
(二）5＇端標記 RNA
逋過 T4 多核苷酸激酶在 5＇端標記 RNA。這個酶將 [32P] 由 [γ-32P]ATP 上轉移到分子的 5＇端. 伹 5＇端標記的 RNA 分子需要先用牛小腸磷酸酶去除非同位素的 5＇磷酸。
1) 用 DEPC 處理的水稀釋 1?2ugRNA 至終體積為 16ul,95℃ 下放置 2 min 后，冰浴5 min, 變性 RNA
2) 加入 2ul10X 磷酸酶反應緩沖液，2ul 牛小腸磷酸酶 (1U/ul);37℃ 反應 30 min
3) 用 TE(pH7.4) 稀釋 RNA 至終體積為 200ul, 加 6ul5mol/LNaCl 如前所述沉淀RNA。
4) 用 TE(pH7.6) 重懸 RNA 至 RNA 濃度為 0.5ug/ul。取 2ulRNA 溶液，95℃ 放置 2 min 后，冰浴 5 min
5) 加 10XT4 多核苷酸激酶緩沖液 4ul[γ32P]ATP(3000Ci/mmol,10mCi/ml),iyT4 多核苷酸激酶 (3?6U/ul)，于 37°C 孵育 30 min
6) 用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳純化已標記的 RNA
(三）3＇端標記 RNA
利用 T4RNA 連接酶和過量的 [32P]p4 以標記 RNA 的 3＇端
1) 將 1?2ugRNA 于 68℃ 放置 2 min 后，冰浴 5 min, 使之變性
2) 加入 4ul10XT4RNA 連接酶緩沖液，4ul DMSO，1ul20umol/LATP,1ul l0ug/ml 無 RNA 酶的牛血清白蛋白，1?2ug RNA,5?10ul[32P]pCp(3000Ci/mmol,lOmCi/ml)，用 DEPC 處理水補足總體積 40ul。4°C 孵育過夜。
3) 用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳純化已標記的 RNA。