| 實驗步驟 |
一材料與設備
1) 限制性內切核酸酶
2) 模板 DNA 或質粒
3)TE
4)TE 飽和酚：氯仿
5) 氯仿：異丙醇 (24:1)
6)3mol/LNaAc(pH5.2)
7) 無水乙醇
8)5×轉錄緩沖液：200 mmol/LTris-HCl(PH7.9),300 mmol/LMgCl2,10 mmol/L 亞精胺，50 mmOl/LNaCl
9)l00 mmol/LDTT
10)RNasin
11)rATP，rGTP,rUTP, 各 2.5 mmol/L
12)[α42P]rCTP(50uCi,10uCi/ul)(lCi=3.7X1010Bq)
13)SPG,T3 或 T7RNA 聚合酶
14)TE-飽和的酚：氯仿：異戊醇 (25：24:l，pH4.5)
15)DNase
16)7.5mol/L 乙酸銨
17) 無水乙醇
18)70% 乙醇
19)DE81 膜
20)0.5moJ/LNa2 HPO4(pH7,0)
21) 液閃儀
22) 瓊脂糖
23) 電泳槽
24) 離心機
二操作方法
1. 制備 DNA 模板
1) 確定克隆位點內或其下游的限制性酶切位點，產生預期的失控轉錄物（run-offtranscript)。盡可能選擇產生 5＇突出或黏性末端的限制酶。如果用的酶產生了 3＇突出端，可以換用其他酶，或補平。
2) 通過瓊脂糖凝膠電泳檢查消化的完成情況。此時將 DNA 樣品置于冰上，如果消化完全則繼續下一步，否則，再加限制性內切核酸酶至 DNA 中，反應 30 min，再進行電泳分析。要注意酶不能超過總體積的 10%，因為酶保存在甘油中，過量的話會影響酶活力。
3) 加入等體積 TE 飽和酚；氯仿，混旋 1 min 抽提 DNA，12000 g 離心 2 min, 轉移上層液相至一新管中，加 1 倍體積的氯仿：異丙醇（24:1）混旋 lmin,12000 g 離心 2 min。
4) 轉移上層液相至一新管中，加 0.1 倍體積的 3mol/LNaAc(PH5.2)，2 倍體積的無水乙醉沉淀 DNA，、-70℃ 放置 30 min，12000 g 離心 2 min
5) 小心倒掉上清，用 1 ml70% 乙醇冼沉淀，12000 g 離心 2 min, 吸棄上清，真空干燥沉淀，然后用無菌水或 TE 緩沖液重懸 DNA 樣品至濃度約為 lmg/ml。
2. 體外轉錄反應
體外轉錄體系一般需要加入同位素標記以增強檢測的靈敏度。RNA 轉錄可以用32P-，33P-35S-或 1 H-標記核糖核苷酸，在 4 種核苷酸中，只有 rCTP 和 rUTP 用于同位素標記。表 3.2 給出了常用的標記核苷酸的特異性。
下面以使用「α32P」rCTP 為例，說明體外轉錄體系的操作程序如下.
1) 按順序依次加入：
5X 轉錄緩沖液 4ul
DTT,100 mmol/L 2ul
RNasin 20-40U
rATP,rGTP,rUTP(各 2.5 mmnol/L) 4ul
線性模板 DNA(0.2?1 mg/ml) 1ul
(a-32P)rCTP(50uCi,10uCi/ul) 5ul
SP6,T3 或 T7RNA 聚合酶 15?20U
加無 RNase 的水至終體積為 20ul
上述組分需在室溫下混合，若在操作，緩沖液中的亞精胺會使 DNA 發生沉淀。
2) 于 37?40℃ 反應 lh,
3) 取出 1ul 測定同位素摻入效率，剩余的樣品可用無 RNase 的 DNase 消化。
3. 轉錄 RNA 產物純化
體外轉錄反應完后，應用
DNA 酶 I 可以把 DNA 模板切除去，這樣可以獲得高敏感性的 RNA 探針。具有生物活性的 RNA 樣品也要求去除 DNA
模板，這時保持 RNA 的完整性是關鍵的，故 DNase 為不含 RNA 酶的 DNA 酶，它可以有效地去除 DNA 而維持新合成的 RNA
的完整性。
1) 在體外轉錄體系內加入 DNA 酶，終濃度為 1U/ug 模板 DNA。
2) 于 37℃ 孵育 15 min
3) 用 TE-飽和的酚：氯仿：異戊醇（25:24:l,pH4.5) 抽提蛋白. 渦旋振蕩 lmin,12000 g 離心
4) 將上層水相轉移到新的離心管中，加入等體積的氯仿：異戊醇（24:1），渦旋振蕩 lmin,12000 g 離心
5) 將上層水相轉移到新的離心管中，可以取少量進行變性膠電泳分析，剩佘的進一步沉淀回收
4. 沉淀回收轉錄 RNA 產物
1) 加入 0.5 倍體積的 7,5mol/L 乙酸銨。
2) 加 2.5 倍體積的無水乙醇，混合后置于一 70℃30mim。
3)12000 g 離心 5 min，小心去除清。
4) 沉淀用 1 ml70% 的乙醇洗滌，干燥，然后溶于 10?20ul 的 TE 緩沖液或水中，存于一 70℃。
5. 確定 RNA 轉錄產物中同位素的摻入比例和 RNA 探針的特異活性
1) 用 19ul 無核酸酶的水稀釋標記好的探針，取稀釋好的樣品 3ul 點至 4 張 DE81 膜上，室溫或燈下使膜干燥。
2) 直接放兩張膜到分開的閃爍瓶中，加入閃爍液并計數。計算每張膜的平均 cpm(每分鐘計數) 值，按下面公式確定起始反應中每微升的 cpm 值：
起始反應的總 cpm/ul=每張膜的平均 cptnX(20 倍稀釋/3ul)
3) 從剩余的兩張膜上洗去未結合的核苷酸，用 50?100 ml,0.5mol/LNa2 HPO4(pH7.0) 洗三次，瀝干水分后放至 70% 乙醇中，取出，室溫或燈下干燥。
4) 把膜放入閃爍瓶后，加入閃爍液計數。計算起始反應中每微升結合到 RNA 上的 cpm 值：
起始反應中結合的 cpm/ul=每張膜的平均 cpmX(20 倍稀釋/3ul)
此公式也適用于估計同位素標記的 RNA 探針的特異活性.
5) 由步驟 2) 和 4) 計算結合百分數。
結合百分數=(結合的 cpm/總 cpm)X100%
按這種方法算出的結合率通常在 70％?100%, 放射性標記核苷酸結合率低如低于 50%) 表明 RNA 合成效率較低。
6) 以 cpm/ugRNA 合成的量計算探針的特異活性。這時要首先計算總的結合 Cpm
總結合 cpm=(結合的 cpm/ul)X20ul 反應體積
下一步需要計箅反應中核苷酸的總納摩爾數，用來確定有多少毫克 RNA 合成；
50uCi [α32)CTP (400uCi/nmol) 相當于 0.121 nmol 32P-CTP/反應。加
12umol/L 未標記 CTP(0.24nmOl) 至 CTP 達到 0.36nmol, 如果獲得最大的 100% 結合，那么 RNA
轉錄產物或標記 RNA 探針中 CTP 就代表了 1/4 的核苷酸，探針中核苷酸結合總量應為（0.36nmolX4) 或 1.44nmol,
估計核苷酸的平均分子質量為 330Da，那么樣品中 RNA 合成的量為 1.44nmolX(330ng/nmol)—475ng。如果從步驟 5)
算出的結合率為 80%，那么實際反應中合成的量為 475ngX0.80=380ng。
SA=總結合 cpm/ugRNA
在這個例子中，SA 就等于總結合 cpm 除以 0.380ug
6. 陽性對照設立與電泳分析
需要設立陽性對照以檢測所用試劑.
和操作步驟是否規范。一般商品化的體外轉錄試劑盒都帶有陽性對照質粒模板。反應體系和樣品紺類似，只需將模板更換并不需加入同位素標記的核苷酸。Promega
公司的 RiboProbe 體外轉錄體系提供的陽性對照質粒含有 T7、T3 和 SP6 等 3 個啟動子，使用不同的 RNA
聚合酶，可以轉錄得到不同大小的轉錄產物。
RNA 電泳時，使用含冇 0.5ug/ml 溴化乙錠的 TAE
緩沖液制備瓊脂糖凝膠或聚丙_烯酰胺凝膠均可。變性膠（含甲醛，乙二醛或 8mol/L 的尿素）可以用于分離變性的
RNA，而用非變性膠分離在甲醛/甲酰胺 RNA 樣品緩沖液中變性的 RNA 也町以得到不錯的結果。
展開
|
| 注意事項 |
1) 使用標準體系時，RNA 回收率低。可能的原因包括：①轉錄體系中的 DNA 模板量不足由于 DMA
模板可以被轉錄緩沖液中的亞精胺沉淀，所以要注意在混合各組分時要在室溫操作并注意加樣順序.②NaCl 濃度過高 (大于 30
mmol/L)。鹽離子濃度過高會嚴重降低 RNA 聚合酶的活性 (只有 50%), 所以應用柱層析除鹽，再用 70% 的乙醇洗滌 1?2
次。③RNA 酶污染. 在所有的體外轉錄體系中都必須加入 RNA 酶抑制劑 (如 RNasin),
所有溶液應盡可能使用試劑盒中配制的，自己配制的溶液一定要用 0.2%DEPC 水作為溶劑。④RNA 聚合酶失活。RNA 聚合酶的活性可以
jffi 過合成一組陽性對照來判定。
2)RNA 轉錄物不完整, 原因包括:①RNA 合成提前終止。在體系中加入冷的
rNTP(與同位素標記的 rNTP 同種類但沒有同位素標記）吋以增加全長轉錄物的合成效率。此外，可以把反應溫度由 37℃ 降低為
30℃②存在聚合酶終止子序列把插入片段重新亞克隆到另一個含不同啟動子的載體，有些序列可以被某一種 RNA
聚合酶識別為終止子序列，但不會同時被另一種 RNA 聚合酶識別。③RNA 樣品緩沖液降解。如果 RNA 樣品緩沖液時間太長或反復凍融，RNA
就可能得到與其真實大小不相符的遷移距離。
3）得到的 RNA 比預期的長的可能原因是：從 DNA 的錯誤鏈起始轉錄。如果 DNA
模板線性化時使用的內切酶產生了 3＇黏末端，得到的 RNA 就可能比預期的長，如果不能避開使用這類限制性內切核酸酶，那么 DNA 應該用
Klenow 大片段處理便之平端化。
展開 |
