葉綠體mRNA3’末端的體外加工
l RNA加工反應
1．在1.5ml微量離心管中加入下列反應液：
緩沖液IVT（20×） 0.5μl
葉綠體蛋白提取物（20μg） Lμl
緩沖液E Mμl
（L＋M＝5μl）
DEPC處理過的水 Xμl
H-RNA（約0.25fmol，每分鐘計數2000） Yμl
（X＋Y＝4.5μl）
以加入H－RNA起始反應，溫和混勻，短暫離心使反應液從管壁上甩下來。
注：
緩沖液IVT（20×）：200 mmol/L KCl, 75 mmol/L MgCl2, 40 mmol/L二硫蘇糖醇（DTT） 用DEPC處理后高壓滅菌。
緩沖液E：20 mmol/L HEPES（pH7.9），60 mmol/L KCl, 12.5 mmol/L MgCl2, 0.1 mmol/L EDTA, 2mmol/L 二硫蘇糖醇（DTT），17％甘油 用DEPC處理后高壓滅菌。
2．25℃溫育60分鐘（或對于動力學實驗為0～60分鐘）。
3．將5μl反應液中移入45μl終止液以終止反應，混勻，置于冰上。
終止反應液：
6 mol/L 尿素
1％十二烷基硫酸鈉（SDS）
4.5 mmol/L 玫瑰紅三羧酸
用DEPC處理并高壓滅菌
4．加入50μl酚/氯仿/異戊醇（25：25：1），混勻，室溫下離心2分鐘。把上層水相（紅色）移到新離心管中，棄掉酚相。
5．再加入1μl 3mol/L乙酸鈉（pH5.5），1μl 10mg/ml tRNA，125μl 100％冰冷乙醇。－20℃放置10分鐘后，4℃離心10分鐘。
6．小心移去上清，將RNA沉淀真空干燥約5分鐘后，重懸RNA于7μl甲酰胺染液中。
7．沸水浴煮RNA重懸液3分鐘，冰上快速冷卻。
l 用PAGE分析RNA產物
1．準備電泳裝置，用洗滌劑洗玻璃板（450px×450px×2px），依次用水，蒸餾水和乙醇沖洗，然后空氣晾干。
2．制備6％丙稀酰胺凝膠液：
溶液A 4.8ml
溶液B 7.2ml
APS（20％） 55μl
TEMED 8μl
倒膠，插入梳子，丙稀酰胺將30分鐘內完全聚合。
注：
溶液A：5×TBE（用10×TBE貯液），7 mol/L尿素，15％丙稀酰胺，0.75％雙丙稀酰胺
溶液B：0.5×TBE（用10×TBE貯液），7mol/L尿素
3．電泳緩沖液為0.5×TBE，30mA下，預電泳直到溫度上升為50℃或電壓上升至1000V（需要約20分鐘）。
4．用電泳緩沖液沖洗泳道以除去預電泳中擴散匯集于泳道的尿素。上RNA樣，在20mA下走膠至溴酚藍到達膠的底部（20～30分鐘）。
5．小心地分開上下玻璃板，把膠移到Whatman 3MM紙上，蓋上Saran?膜，再放上一層Whatman 3MM紙于Saran?膜上，置于凝膠干燥器上干燥。
6．用增感屏于－80℃，干凝膠X光片曝光6～15小時。
蛋白質與RNA的交聯
l UV交聯反應
1．在1.5ml微量離心管中加入下來反應物（X-RNA除外）：
緩沖液IVT（20×） 0.75μl
葉綠體蛋白提取物（20μg） Lμl
緩沖液E Mμl
（L＋M＝7.5μl）
poly（U）（0.1mg/ml） 1μl
DEPC處理過的水 Xμl
X-RNA（約1.25fmol,每分鐘計數100 000） Yμl
（X＋Y＝6.5μl）
總體積： 15.75μl
室溫下放置5分鐘，加入X-RNA，溫和混合，短暫離心，將反應液從管壁上甩下來。
2．室溫下放置10分鐘。
3．小心地打開管蓋，放至UV交聯儀下，在工作功率1.8J（即刻度為2×9000）進行UV交聯，如果沒有UV交聯儀，可在殺菌燈下150px照30分鐘。
4．加入1μl 0.5mg/ml RNase A液，在37℃溫育20分鐘。
5．加入4μl×Laemmli樣品緩沖液，在80～100℃下處理樣品1分鐘。
l 蛋白質的SDS－PAEG電泳分析
1．準備制膠裝置，洗玻璃板，可選用450px×450px×2px玻璃板或200px×250px（微型凝膠）玻璃板。
2．制備13％丙稀酰胺分離膠溶液：
丙稀酰胺（30％）/雙丙稀酰胺（0.8％） 8.7ml
H2O 8.8ml
分離膠緩沖液（8×） 2.5μl
APS（20％） 75μl
TEMED 30μl
3．制備濃縮膠溶液：
丙稀酰胺（30％）/雙丙稀酰胺（0.8％） 1.3ml
H2O 3.9ml
濃縮膠緩沖液（4×） 1.8ml
APS（20％） 45μl
TEMED 10μl
4．在20mA直流下電走膠直至溴酚藍到達膠的底部（2～3小時）。
5．小心分開玻璃板，把膠移入玻璃皿中，按下列程序銀染蛋白。
l 陽性成像銀染
按Merril等1984的方法，下述的步驟均在室溫下進行。
1．在含有50％甲醇/12%冰乙酸的400ml水溶液中處理10分鐘以固定凝膠。換用新溶液重復一次。
2．在含有10％甲醇/5％冰乙酸水溶液400ml中處理10分鐘以漂洗凝膠。換用新溶液重復一次。
3．將膠浸入含3.4mmol/L重鉻酸鉀/3.2mmol/L硝酸200ml水溶液中15分鐘。
4．將膠浸入含12mmol/L硝酸銀的150ml水溶液中，放置15分鐘。
5．用水漂洗3次。
6．在含有0.5ml 37％甲醛溶液的0.28mol/L碳酸鈉150ml溶液中快速洗膠兩次后，換上150ml新鮮溶液，讓凝膠顯像3～15分鐘。
7．去掉顯像劑，加入200ml 3％乙酸水溶液，放置5分鐘終止顯像。
8．用5％甘油200ml水溶液漂洗成像凝膠10分鐘。
9．在約80℃凝膠干燥器上干燥成像凝膠，用增感屏－80℃對X