首次發現dsRNA能夠導致基因沉默的線索來源于線蟲Caenorhabditis elegans的研究。>1995年，康乃爾大學的Su Guo博士和>Kemphues在試圖阻斷秀麗新小桿線蟲（C. elegans）中的par-1基因時，發現了一個意想不到的現象。她們本是利用反義RNA技術特異性地阻斷上述基因的表達，而同時在對照實驗中給線蟲注射正義RNA（sense RNA）以期觀察到基因表達的增強。但得到的結果是二者都同樣地切斷了par-1基因的表達途徑。這是與傳統上對反義RNA技術的解釋正好相反的。該研究小組一直沒能給這個意外以合理解釋。
這個奇怪的現象直到3年后才被解開。1998年2月，華盛頓卡耐基研究院的Andrew Fire和馬薩諸塞大學癌癥中心的Craig Mello才首次揭開這個懸疑之謎。通過大量艱苦的工作，他們證實，Su Guo博士遇到的正義RNA抑制基因表達的現象，以及過去的反義RNA技術對基因表達的阻斷，都是由于體外轉錄所得RNA中污染了微量雙鏈RNA而引起。當他們將體外轉錄得到的單鏈RNA純化后注射線蟲時發現，基因抑制效應變得十分微弱，而經過純化的雙鏈RNA卻正好相反，能夠高效特異性阻斷相應基因的表達。實際上每個細胞只要很少幾個分子的雙鏈RNA已經足夠完全阻斷同源基因的表達。后來的實驗表明在線蟲中注入雙鏈RNA不單可以阻斷整個線蟲的同源基因表達，還會導致其第一代子代的同源基因沉默，該小組將這一現象稱為RNA干擾（RNA interference ,簡稱RNAi）。
RNAi潛在的作用促使Fire和Timmons 繼續實驗。他們將一種能夠表達與+ C. elegans unc-22基因同源的雙鏈RNA的基因工程細菌喂食線蟲，結果線蟲表現出類似unc-22缺陷的表型。后繼的實驗表明將線蟲浸入雙鏈RNA中同樣可以誘導基因沉默——這種技術使得大規模篩選線蟲R NA i 誘導的功能缺失突變體成為可能，并引發后繼的大量針對這種模式生物基因敲除的研究。
在隨后的短短一年內，RNAi現象又陸續在果蠅，錐體蟲，真菌，渦蟲，植物及斑馬魚等真核生物的研究中被發現，這種情況揭示了RNAi現象很可能出現于生命進化的早期階段。在RNAi的機制被真正認識之前，自然存在的RNAi現象曾在這些生物體中被分別描述為：
1）真菌種屬中脈孢菌的“鎮壓”（qelling）作用。
2）植物中的轉錄后基因沉默（posttranscriptional gene silencing, PTCS）和基因共同抑制（co-suppression），以及RNA介導的抗病毒作用。這是一種針對頻繁出現的病毒感染的保護機制。
3)動物中包括水螅、渦蟲、果蠅和線蟲中的RNAi現象，具有抑制轉座子擴散的功能。
4)脊椎動物中斑馬魚和小鼠的RNAi現象。
由于這些現象中存在共同的作用媒介siRNA，以及不同種屬生物中參與基因的同源性，研究者認為以上種種沉默現象都基于相同的核心機制，而保護性對抗病毒和轉座子可能是RNAi途徑的核心功能[9]。
20多年前，在對矮牽牛（petunias）進行的研究中有個奇怪的發現：Rich Jorgens en和同事將一個能產生色素的基因置于一個強啟動子后，導入矮腳牽牛中，試圖加深花朵的紫顏色，結果沒看到期待中的深紫色花朵，多數花成了花斑的甚至白的。Jorgensen 將這種現象命名為協同抑制（cosuppression ），因為導入的基因和其相似的內源基因同時都被抑制。開始這被認為是矮牽牛特有的怪現象，后來發現在其他許多植物中，甚至在真菌中也有類似的現象，特別是在脈孢霉Neurospora+ 中進行了詳細的研究（在這里被稱為quelling 現象）。
然而是什么原因導致這種基因沉默的現象呢？盡管對于部分植物來說，轉基因引發的基因沉默可能是因為基因特異的甲基化而導致，這被稱為轉錄階段基因沉默（transcriptional ge ne silencing, or TGS ），但確實有部分的植物中的基因沉默是在轉錄后發生的，稱為post transcriptional gene silencing, or PTGS。核轉移實驗表明同源轉錄本確實有出現，但是很快在胞漿中被降解，沒有積聚。基因沉默可以在異核體的細胞核之間傳遞。后來進一步證實，在植物中，將出現轉基因導致基因沉默的植物嫁接到另一沒有基因沉默的植物中，同樣可以誘發PTGS。在后來線蟲和果蠅的實驗中我們知道導致植物中的PTGS的反式作用因子是雙鏈RNA。
轉基因會引發PTGS，然而基因沉默也可能被一些病毒誘發。一旦被引發，PTGS由一種可擴散的反式作用分子介導。這首先在脈孢霉Neurospora中得到證實：Cogoni和他的同事發現基因沉默可以在異核體的細胞核之間傳遞。后來 Palauqui和同事進一步證實，在植物中，將出現轉基因導致基因沉默的植物嫁接到另一沒有基因沉默的植物中，同樣可以誘發PTGS。在后來線蟲和果蠅的實驗中我們知道導致植物中的PTGS的反式作用因子是雙鏈RNA。
在果蠅的研究中同樣發現了RNAi。盡管采用能生產dsRNA的酵母喂食果蠅實驗以失敗告終，但是通過顯微注射或者通過基因槍將dsRNA注入果蠅胚胎中、或者將帶有反向重復序列的DNA導入果蠅中能夠引發基因沉默。在過去的幾年中RNAi技術在果蠅的研究中成為一種反向遺傳工具，用于鑒定功能缺失表型。
注射的RNAi如何引發基因沉默？在過去的數年中多個研究小組進行了不懈的努力。Baul combe和Hamilton首先在發生協同抑制的植物中鑒定出一些在沒有發生基因沉默的植物中并不存在的大約25個堿基大小的RNA，這些RNA分別與沉默基因的正義和反義鏈互補。這成為揭示RNAi秘密的第一條關鍵線索。
后來在果蠅細胞中的實驗進一步揭示這個秘密。在一系列著名的實驗中，Zamore 和同事發現注入果蠅細胞的dsRNA被切割為21～23堿基長短的RNA片段，他們同時發現：與dsRNA同源的內源基因的mRNA，只在和dsRNA對應的部位被切割成為21—23核苷酸長的片斷。很快，RNAi的機制越來越清楚了。