RNAi實驗原理與方法（一）

通過生化和遺傳學研究表明，RNA干擾包括起始階段和效應階段(inititation and effector steps)。在起始階段，加入的小分子RNA被切割為21-23核苷酸長的小分子干擾RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。證據表明；一個稱為Dicer的酶，是RNase III家族中特異識別雙鏈RNA的一員，它能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導入或者由轉基，病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，切割將RNA降解為19-21bp的雙鏈RNAs(siRNAs)，每個片段的3’端都有2個堿基突出。

在RNAi效應階段，siRNA雙鏈結合一個核酶復合物從而形成所謂RNA誘導沉默復合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活RISC需要一個ATP依賴的將小分子RNA解雙鏈的過程。激活的RISC通過堿基配對定位到同源mRNA轉錄本上，并在距離siRNA3’端12個堿基的位置切割mRNA。盡管切割的確切機制尚不明了，但每個RISC都包含一個siRNA和一個不同于Dicer的RNA酶。

另外，還有研究證明含有啟動子區的dsRNA在植物體內同樣被切割成21-23nt長的片段,這種dsRNA可使內源相應的DNA序列甲基化,從而使啟動子失去功能,使其下游基因沉默.

實驗試劑

 RNase III、 DNA Oligo、Taq酶、dNTP、氯化鈣、磷酸緩沖液、克隆所需試劑、 siRNA合成試劑盒等

實驗步驟

(一)siRNA的設計

1. 在設計RNAi實驗時，可以先在以下進行目標序列的篩選：

http://www.genesil。。ｃｏｍ/business/products/order2.htm

http://www.ambion。。ｃｏｍ/techlib/misc/siRNA_finder.html

http://www.ic.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.html

http://design.dharmacon.com/rnadesign/default.aspx?SID=45358710

1.       RNAi目標序列的選取原則：

(1)從轉錄本（mRNA）的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二連序列，并記下其3'端的19個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點。有研究結果顯示GC含量在45%—55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。

Tuschl等建議在設計siRNA時不要針對5'和3'端的非編碼區（untranslated regions，UTRs)，原因是這些地方有豐富的調控蛋白結合區域，而這些UTR結合蛋白或者翻譯起始復合物可能會影響siRNP核酸內切酶復合物結合mRNA從而影響siRNA的效果。

(2)將潛在的序列和相應的基因組數據庫（人，或者小鼠，大鼠等等）進行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。

例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）

(3)選出合適的目標序列進行合成。通常一個基因需要設計多個靶序列的siRNA，以找到zui有效的siRNA序列。

3.陰性對照

一個完整的siRNA實驗應該有陰性對照，作為陰性對照的siRNA應該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結果以保證它和目的靶細胞中其他基因沒有同源性。

4.目前已證實的siRNA可以在下面的網頁找到：

http://design.dharmacon.com/catalog/category.aspx?key=49

http://www.ambion。。ｃｏｍ/techlib/tb/tb_502.html

http://web.mit.edu/mmcmanus/www/siRNADB.html

http://python.penguindreams.net/Order_Entry/jsp/BrowseCatalog.jsp?Category=Published

(二)siRNA的制備

目前為止較為常用的方法有通過化學合成，體外轉錄，長片斷dsRNAs經RNase III 類降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)體外制備siRNA，以及通過siRNA表達載體或者病毒載體，PCR制備的siRNA表達框在細胞中表達產生siRNA。

體外制備

1.化學合成

許多國外公司都可以根據用戶要求提供高質量的化學合成siRNA。主要的缺點包括價格高，定制周期長，特別是有特殊需求的。由于價格比其他方法高，為一個基因合成3—4對siRNAs 的成本就更高了，比較常見的做法是用其他方法篩選出zui有效的序列再進行化學合成。zui適用于：已經找到zui有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進行研究。不適用于：篩選siRNA等長時間的研究，主要原因是價格因素

2.體外轉錄

以DNA Oligo為模版，通過體外轉錄合成siRNAs，成本相對化學合成法而言比較低，而且能夠比化學合成法更快的得到siRNAs。不足之處是實驗的規模受到限制，雖然一次體外轉錄合成能提供足夠做數百次轉染的siRNAs，但是反應規模和量始終有一定的限制。而且和化學合成相比，還是需要占用研究人員相當的時間。值得一提的是體外轉錄得到的siRNAs毒性小，穩定性好，效率高，只需要化學合成的siRNA量的1/10就可以達到化學合成siRNA所能達到的效果，從而使轉染效率更高。zui適用于：篩選siRNAs，特別是需要制備多種siRNAs，化學合成的價格成為障礙時。不適用于：實驗需要大量的，一個特定的siRNA。長期研究。