RRLCUV／MS建立可靠的中藥質控方法

  我國擁有長期使用中藥和中藥制劑的歷史，中藥一直未能得以飛速發展的主要原因是缺乏科學的質量控制標準。如今，對中藥的質量控制僅局限于外觀檢查是遠遠不夠的。隨著新技術的發展，研究人員已經發現某些中藥中有幾百種化合物，其濃度范圍很寬，而且由于產地和采摘時期不同，以及炮制和加工工藝不同，中草藥的成分也各不相同。因此，對中藥化合物的質量控制極具挑戰性。由于特殊配方的中藥制劑通常是由多種中藥組成，因此只測定中藥制劑中一兩種成分進行質量控制已無法滿足要求。例如用于治療冠心病的中成藥芪參益氣滴丸，就包含黃芪、丹參、三七和降香4種中藥。

　　本研究以芪參益氣滴丸為樣品，用高分離度快速液相色譜(RRLC)-紫外-可見檢測器和質譜聯用，建立中藥質量控制的新方法。主要目標是建立一種可靠的方法，能夠選測定在加熱和混合過程中不變的潛在目標化合物。

　　實驗內容

　　實驗儀器

　　Agilent 1200系列RRLC系統包括：帶真空脫氣機的SL型二元泵、SL型高性能自動進樣器、配置微量流通池(2μl體積，3mm光程)的SL型柱溫箱和二極管陣列檢測器SL;

　　Agilent 6410四極桿質譜儀，配置ESI離子源;

　　Agilent 化學工作站B.02.01SR，用于數據采集和分析;

　　Agilent ZORBAX XDB C18 RRHT色譜柱，3.0×50mm, 1.8μm粒徑。

　　標準品

　　丹酚酸B、丹參酮I、丹參酮IIA、隱丹參酮、丹參素、三七皂甙R1和黃芪甲苷均購自中國藥品生物制品檢定所(NICPBP)，人參皂甙Rg1、人參皂甙Rb1、原兒茶醛、原兒茶酸、人參皂甙Re和人參皂甙Rc 購自Sigma-Aldrich公司(美國)。

　　溶劑

　　乙腈購自Fisher公司(美國)，水由Milli-Q純水系統制備。

　　樣品和樣品制備

　　芪參益氣滴丸、黃芪、丹參、三七的中間提取物，及降香精油，由中國TASLY制藥公司提供。原藥材購自當地中藥店。滴丸、中藥提取物和中藥原料溶于70%甲醇/水溶液中，超聲提取30min，用0.22μm濾膜過濾。

　　RRLC方法

　　流動相A：0.1%甲酸水;流動相B：乙腈，含0.1%甲酸;

　　梯度：0min，10%B;8min，38%B;12min，100%B;持續3min，然后10%B;

　　流速： 1.0ml/min(被動分流器將進入MS的流速降至0.4ml/min);

　　柱溫：45℃;檢測波長：203nm;峰寬：0.5s;狹縫寬度：4nm;光譜：190~400 nm，2nm步進。

　　質譜方法

　　掃描：80~1400(正/負);碰撞誘導解離電壓：70(正/負);干燥氣體：12L/min;

　　霧化器壓力：50psi;干燥氣溫度：50℃;毛細管電壓：3200 V(正/負)。

　　結果與討論

　　用安捷倫方法轉換計算器(光盤發行號5989-5130EN)將常規液相色譜方法轉換成高分離度快速液相色譜方法。

　　丹參三七黃芪和降香提取物的比較

　　由圖1可見，在203nm檢測波長下，丹參和三七的色譜圖與混合提取物有很大區別。混合和加熱后，某些峰消失了，同時出現了一些新的色譜峰。目標化合物篩選是質量控制的重要步驟，可以確定加工過程中這些化合物是否發生了變化。大多數研究者都用203 nm進行檢測，因為主要活性化合物是皂甙，在203 nm波長下有弱吸收。但203 nm處的大峰可能與質量控制無關，那些小峰可能對研究活性成分更重要。因此，需要另一種靈敏度更高的檢測器，提供這些成分的更多信息。

　　圖1. 各中藥丹參、三七及混合提取物的色譜圖。

　　不同檢測器和條件之間的比較

　　圖2顯示了紫外和MS檢測的不同結果。在MS的總離子色譜圖中有更多的峰，因為某些成分紫外吸收很弱或者沒有吸收。用MS檢測增加了另一維數據，并得到了這些不同化合物的結構信息。負離子模式給出了這些峰更完整的信息，可以對質量控制的目標化合物進行鑒定。

　　圖2. 丹參三七組合的色譜圖，UV和MS檢測得到了不同結果。

　　芪參益氣滴丸和不同提取物之間的比較

　　圖3顯示了丹參、黃芪和降香提取物與芪參益氣滴丸(由這3種提取物和其它填加劑制成)的色譜圖。標記數字的峰就是對這一中藥制劑質量控制篩選到的目標化合物。根據UV和MS數據，研究不同的色譜峰，以確定這些化合物是否發生了改變，,鑒別結果如表1所示。

　　圖3. 三種中藥組合及滴丸樣品的負離子TIC比較。

　　表1. 目標化合物的結構式和檢測信息

　　小結

　　本文介紹的RRLC紫外和MS檢測方法可根據UV和MS檢測器提供的信息跟蹤中藥中幾種成分的質量，因此較目前藥典控制單一組分的質控法更為可靠。由于中藥中的成分可能在炮制和加工過程中發生變化，因此對其的跟蹤非常重要。