RTPCR原理與實驗操作步驟1

一、知識背景：

1、基因表達：DNA RNA Protein

單拷貝基因表達存在逐步放大機制，如一個蠶絲心蛋白基因 104個絲心蛋白mRNA（每個mRNA存活4d，可以合成105個絲心蛋白） 共合成109個絲心蛋白 。因此單拷貝基因的mRNA表達水平對于其功能水平的調控是非常重要的。

2、PCR技術(olymerase chain reaction)：即聚合酶鏈式反應。

在模板、引物和四種脫氧核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促反應，其特異性由兩個人工合成的引物序列決定。反應分三步：

A、變性：通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA；

B、退火：將反應混合液冷卻至某一溫度，使引物與模板結合。

C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5‘ 3’方向延伸。

以上三步為一個循環，如此反復。

3、逆轉錄酶和RT-PCR

逆轉錄酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒體內的依賴RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三種活性：

1、依賴RNA的DNA聚合酶活性：以RNA為模板合成cDNA第一條鏈；

2、Rnase水解活性：水解RNANA雜合體中的RNA；

3、依賴DNA的DNA聚合酶活性：以第一條DNA鏈為模板合成互補的雙鏈cDNA.

二、RT-PCR的準備：

1、引物的設計及其原則：

1）引物的特異性決定PCR反應特異性。因此引物設計是否合理對于整個實驗有著至關重要的影響。在引物設計時要充分考慮到可能存在的同源序列，同種蛋白的不同亞型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA對引物的特異性的影響。盡量選擇覆蓋相連兩個內含子的引物，或者在目的蛋白表達過程中特異存在而在其他亞型中不存在的內含子。

2）引物設計原則的把握：引物設計原則包括

a、引物長度:一般為15～30bp ，引物太短會影響PCR的特異性，引物太長PCR的最適延伸溫度會超過Taq酶的最適溫度，也影響反應的特異性。

b、堿基分布：四種堿基最好應隨機分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特別是連續出現3個以上的單一堿基。GC含量（Tm值）：40％～60％，PCR擴增的復性溫度一般是較低Tm值減去5～10度。

c、 3‘端要求：3’端必須與模板嚴格互補，不能進行任何修飾，也不能有形成任何二級結構的可能。末位堿基是A時錯配的引發效率最低，G、C居中間，因此引物的3’端最好選用A、G、C而盡可能避免連續出現兩個以上的T。

d、引物自身二級結構：引物自身不應存在互補序列，否則會自身折疊成發夾狀結構或引物自身復性。

e、引物之間的二級結構：兩引物之間不應有多于4個連續堿基互補，3’端不應超過2個。

f、同源序列：引物與非特異擴增序列的同源性應小于連續8個的互補堿基存在。

g、5’端無嚴格限制：5’末端堿基可以游離，但最好是G或C，使PCR產物的末端結合穩定。還可以進行特異修飾（標記、酶切位點等）等等。

根據實驗目的選擇適當的引物。常用引物設計軟件如Primer5.0，Oligo6.0等對于這些條件都可以自行設置。

2、耗材：實驗所用的接觸樣品的耗材如凍存管、槍頭、EP管之類事先都需經過0.1%DEPC水浸泡處理，除去RNA酶，防止操作過程中RNA降解。然后經高壓滅活（滅菌和滅活DEPC）。

3、試劑準備：變性液、水飽和酚、乙酸鈉、氯仿、異丙醇、75%酒精、經DEPC處理并高壓的水。

三、RNA的提取方法：

RT－PCR中從細胞分離的RNA的質量至關重要，包括RNA的純度和完整性。RNA分離的最關鍵因素是盡量減少RNA酶的污染。但RNA酶活性非常穩定，分布廣泛，除細胞內源性RNA酶外，環境中也存在大量RNA酶。因此在提取RNA時，應盡量創造一個無RNA酶的環境，包括去除外源性RNA酶污染和抑制內源性RNA酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶，通過RNA酶的阻抑蛋白Rnasin和強力的蛋白質變性劑如異硫氰酸胍抑制內源性RNA酶。

實驗操作步驟

一、實驗器具與材料：

1、移液槍：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl

2、吸頭：1ml、200μl、20μl

3、勻漿管：5ml

4、吸頭臺：放置1ml吸頭的一個，放置20μl吸頭的一個

5、EP管：1.5ml、0.2ml、100μl

6、試劑瓶：2個60ml的棕色試劑瓶（廣口，帶蓋）

1個125ml的白色試劑瓶（放無水乙醇）

7、量筒：50ml、250ml、500ml

8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml

9、試管架：5ml、1.5ml、20μl

10、鹽水瓶：250ml、500ml各2個備用，一個裝無水乙醇，另一個裝DEPC水

11、鋁制飯盒：4個

12、塑料小飯盒：1個

13、大瓷缸：2個

14、錫泊紙：一卷

15、卷紙：2卷

16、三角燒瓶：帶蓋，稍大