八、PCR產物電泳
先將1-10μl左右PCR產物，加已點在紙上的溴酸蘭，反復吸打混勻后進行電泳，一般電流為10mA，電源100V，電泳30分鐘，紫外燈下觀察，滿意的結果掃描打印。
九、幾個注意點：
1、逆轉錄的關鍵步驟是立即冰水浴？
2、Rt時，先打開PCR預熱30分鐘。
3、RNA抽提前，打開離心機預冷。
TRIzol法抽提總RNA
細胞1×107
組織100mg
↓
加1mlTRIzol
細胞用1ml加樣器吹至液體澄清且無細胞團塊
↓
勻漿（要徹底，后轉至EP管）
（組織勻漿量>100mg時分裝1ml/每EP管）
↓
顛倒混勻10下，室溫5分鐘
↓
加氯仿1/5體積（0.2ml）（必須按總體積的1/5）
↓
顛倒混勻10下，室溫5分鐘
↓
4℃，離心12000g，15分鐘
↓
轉上層水相（約400μl）于另一1.5mlEP管中
↓
加等體積異丙醇（約400μl），混勻室溫10分鐘
↓
4℃，離心12000g，10分鐘
↓
棄上清
↓
加冰預冷的75%乙醇（用DEPC水配）1ml
↓
4℃離心7500g，5分鐘
↓
棄上清，空氣干燥5-10分鐘（不能完全干燥）
↓
溶于DEPC水中至20μl（10μl-20μl）
（可在55-60℃水中，<10分鐘助溶）
注：
1、RNA若用于核酸轉移應溶解于樣本緩沖液中，否則DEPC溶解
2、細胞組織加TRIzol勻漿后，可在-60℃放置至少一個月（甚至可一年以上）
3、RNA在75%乙醇中，2-8℃至少可保存一周，-20℃至少可保存一年
兩步法RT-PCR
（第一步：逆轉錄反應）
試劑 濃度 體積 終濃度
RNA 23μl(11.5μl)
Oligo(dT)15 0.05μg/μl 4μl(2μl) 0.005μg/μl
（稀釋10倍后用）
↓
混勻，離心，70℃ 5min
↓
立即冰水浴，稍離心
↓
試劑 濃度 體積 終濃度
M-MLV Buffer 5× 8μl (4μl) 1×
dNTP 10mM 2μl (1μl) 0.5mM
RNasin 40U/μl 1μl (0.5μl) 20μ
M-MLV 200U/μl 2μl (1μl) 200U
總體積40μl（20μl）
↓
混勻，離心，42℃ 60min
↓
95℃ 10min（破壞MLV）
↓
4℃保存
兩步法RT-PCR
（第二步：PCR反應）
總體積20μl(50μl)
試劑 濃度 體積 終濃度
Taq Buffer 10× 2μl (5μl_) 1×
MgCl2 25mM 1.2μl (3μl) 1.5mM
dNTP 10mM 0.2μl (0.5μl) <200uM
上游引物 10pmol/μl 0.3μl (1μl) 10pmol
下游引物 10pmol/μl 0.3μl (1μl) 10pmol
cDNA模板 X (?) (1-10μl)
DEPC水 20μl-4.3μl-X