關于平臺期和線性期的問題，實際上線性期是指數期，只不過碰巧2的冥和2的倍數是相同的。看上去任何一個時期都可以，實際上是不對的，因為牽涉到酶促動力學的問題，這個我也不懂，有一些專門的文章，好像，涉及到很多化學的東西。我們學醫的，也沒必要知道那些，但是其中主要是因為模板引物酶原料和buffer之間的關系，這種反應單靠改變其中一種成分沒有用的，酶一直是過量，再加酶也沒用，引物ntp都是這樣。煙鬼正傳，最好選線性期的開始階段，但是要在你的凝膠成像分辨范圍內，所以選一個這兩種的契合點。給你一張圖你就明白了，再開始的時候酸的是切線，這圖我在
*** 帖過。
關于引物設計，再可能的情況下，除了常規要求之外，最好兼顧跨內含子（不過，根據要求，還可以專門設計隔內含子的，這樣還可以用于基因組PCR）、長度小于500bp－600bp等等。
引物當然要設計成一樣的退火溫度，即使不再一管中，也要一樣的，要在一臺機器里啊。我的引物占了冰箱一格，大部分是一個溫度，這樣任何幾個都可以拿來披，也不用查。
我反復說過了，別用軟件，就用眼睛看，軟件涉及的在好，有些基因在它出軟件的時候，還沒發現呢，跟不要說在基因組的位置和序列了，怎么考慮內含子的問題呢？
18s的引物也和著名的βactin一樣是設計的，只要拿到序列就可以了，但是限制是只能用總RNA為模板，但是比actin和bubulin等可準多了，更不要說GAPDH這個破爛了。18s除了在細胞中更相同（量）外，主要是它占的比例遠遠高于看家基因，所以定量更加準確，我想，不知對不對，請幾位主任和eeflying指教。我認為，就像你用某一種東西的數量去概括，因該選那種多的東西，說一座房子是由2000塊磚造成的，比說又29根梁更準確吧。更不要說沒有看家基因不看家的缺點，因為他是服務于整個基因組表達譜什么的。
PE有專門的用于實時PCR的內參試劑盒，就是用18s，不過我們看懂使用的那條序列，不知有沒有人用過，告知其序列和genbank號。
正好問一下，我查了一些序列，一直沒有去合成，主要是因為手上的actin的熒光探針還沒有完，當初和成了一堆。
有那位高手用過18s的內參，請問您的序列（我指的是模板的序列）？
原位雜交最好用RNA做探針，效果好一些，反正你有錢賣roche的盒子，而且量也能保證，因為轉錄過程嘛，沿著一條線突突地跑就是了。正義反義也容易理清。
我覺得做RT-PCR的方法和條件及應注意的事項就是那么幾條,許多專業書都有詳細的描述,但是許多人還是歷經多次磨難，有時就是得不出結果。因此，我認為因為每個人所要克隆的片斷不同，引物不同等，因此對不同的人來說還是有他自己的特殊性,我的以下經歷說明：做實驗時各人的情況不同,做不出時還是要好好動一下腦子。
記得我開始我的ＲＴ－PCR時，按常規方法，提取總ＲＮＡ后，首先用自己設計的下游引物進行逆轉錄，不斷改變反應條件，進行了Ｎ次均沒有結果。后來考慮到本人的克隆的PCR的片斷位于我們實驗另一位同學克隆的片斷當中，而該同學已經用RT-PCR克隆出她的片斷（盡管她用這些ＲＴ－ＰＣＲ產物做模版再進行ＰＣＲ時也沒辦法重復出她的產物），因此，我先用她的引物和條件擴增出她的片斷，然后用她的ＲＴ－ＰＣＲ產物作模板（有點改進，逆轉錄反應換用了９mers隨機引物），用我的引進物進行一般PCR，終于得到我的產物，測序結果完全正確。盡管我的這個經歷別人很人遇到，但足可以說明實驗可以有自己的模式，書本的知識和別人的經驗很重要，但有時也不定要受到書本框框和別人經驗的限制
請問：
1 引物的特異退火溫度怎樣設定？可以根據gc 和at含量算出嗎？可以用引物報告單上的Tm值嗎？
2 PCR時20微升體系中cDNA應加多少比較合適？MgCl2應加多少？各個成分的量有無確定標準？
3 PCR結果跑電泳，actin有，但跑不出目的條帶，有幾種原因？與cDNA的量少有關嗎？Mg離子太多是否會抑制Taqase的活性？
一般來說引物報告單傷得是對的,也可以自己算,實際上重要的各條引物一致,剩下的可以摸的.
20中是指體積還是量?只要不明顯改變體系的離子強度, 加1,2ul都可以的.mg要調的,但我總覺得沒有書里講的那么玄乎,我都是常年不變的.
如果內參照有,目的沒有,至少證明不是"美麗惹"的禍. 原因書里應該都說了.
在所有RNA實驗中，最關鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實驗失敗的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶廣泛存在而穩定，一般反應不需要輔助因子。因而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會引起RNA在制備與分析過程中的降解，而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響
RNA分析的結果，所以RNA的制備與分析操作難度極大。
在實驗中，一方面要嚴格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制內源性的 RNA酶。RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。
外源性的RNA酶存在于操作人員的手汗、唾液等，也可存在于灰塵中。在其它分子生物學實驗中使用的RNA酶也會造成污染。這些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑。而各種組織和細胞中則含有大量內源性的RNA酶。
一、 防止RNA酶污染的措施
1. 所有的玻璃器皿均應在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長時間。
2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。
3. 有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min，然后用0.1% DEPC水沖洗，晾干。