寡聚(dT)纖維素柱純化mRNA
一、試劑準備
1．3M醋酸鈉（pH 5.2）
2．0.1M NaOH
3．1×上樣緩沖液：20mM Tris-HCl(pH 7.6)；0.5M NaCl；1M EDTA（pH 8.0）；0.1%SLS(十二烷基氨酸鈉。配制時可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，經高壓消毒后按各成分確切含量，經混合后再高壓消毒，冷卻至65℃時，加入經65℃溫育（30min）的10%SLS至終濃度為0.1%。
4．洗脫緩沖液：10mM Tris-HCl(pH 7.6)；1mM EDTA(pH 8.0)；0.05% SDS
5．無水乙醇、70%乙醇
6．DEPC
二、操作步驟
1．將0.5-1.0g寡聚（dT）-纖維懸浮于0.1M的NaOH溶液中。
2．用DEPC處理的1ml注射器或適當的吸管，將寡聚（dT）-纖維素裝柱0.5-1ml，用3倍柱床體積的DEPC H2O洗柱。
3．使用1×上樣緩沖液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。
4．將RNA溶解于DEPC H2O中，在65℃中溫育10min左右，冷卻至室溫后加入等體2×上樣緩沖液，混勻后上柱，立即收集流出液。當RNA上樣液全部進入柱床后，再用1×上樣緩沖液洗柱，繼續收集流出液。
5．將所有流出液于65℃加熱5min，冷卻至室溫后再次上柱，收集流出液。
6．用5-10倍柱床體積的1×上樣緩沖液洗柱，每管1ml分部收集，OD260測定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很高，其內含物為無Poly(A)尾的RNA。后部分收集管中流出液的OD260值很低或無吸收。
7．用2-3倍柱容積的洗脫緩沖液洗脫Poly(A+)RNA，分部收集，每部分為1/3-1/2柱體積。
8．OD260測定Poly(A+)RNA分布，合并含Poly(A+)RNA的收集管，加入1/10體積3M NaAc（pH5.2）、2.5倍體積的預冷無水乙醇，混勻，-20℃放置30min。
9．4℃離心，10000g×15min，小心吸棄上清。用70%乙醇洗滌沉淀。[注意：此時Poly(A+)RNA的沉淀往往看不到]。4℃離心，10000g×5min，棄上清，室溫晾干。
10. 用適量的DEPC H2O溶解RNA。
三、注意事項
1．整個實驗過程必須防止Rnase的污染。
2．步驟（4）中將RNA溶液置65℃中溫育然后冷卻至室溫再上樣的目的有兩個，一個是破壞RNA的二級結構，尤其是mRNA Poly(A+)尾處的二級結構，使Poly(A+)尾充分暴露，從而提高Poly(A+)RNA的回收率；另一個目的是能解離mRNA與rRNA的結合，否則會導致rRNA的污染。所以此步驟不能省略。
3．十二烷基肌氨酸鈉鹽在18℃以下溶解度下降，會阻礙柱內液體流動，若室溫低于18℃最好用LiCl替代NaCl。
4．寡聚（dT）-纖維素柱可在4℃貯存，反復使用。每次使用前應該依次用NaOH、滅菌 ddH2O、上樣緩沖液洗柱。
5．一般而言，107哺乳動物培養細胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA，約相當于上柱總RNA量的1%-2%。
RNA酶保護試驗((RNase Protection Assay,RPA)是通過液相雜交的方式,用反義RNA探針與樣品雜交，以檢測RNA表達的技術。與Northern雜交和RT-PCR比較，RPA有以下幾個優點：
1． 檢測靈敏度比Northern雜交高。由于Northern雜交步驟中轉膜和洗膜都將造成樣品和探針的損失，使靈敏度下降，而RPA將所有雜交體系進行電泳，故損失小，提高了靈敏度。
2． 由于PCR擴增過程中效率不均一和反應“平臺”問題，基于PCR產物量進行分析所得數據的可*性將下降，而RPA沒有擴增過程，因此，分析的數據真實性較高。
3． 由于與反義RNA探針雜交的樣品RNA僅為該RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA樣品仍可進行分析。
4． 步驟較少，耗時短。與Northern雜交相比，省去了轉膜和洗膜的過程。
5． RNA-RNA雜交體穩定性高，無探針自身復性問題，無須封閉。
6． 一個雜交體系中可同時進行多個探針雜交，無競爭性問題。
7． 檢測分子長度可以任意設置，靈活性大。
RPA的缺點是需要同位素標記探針。
一、試劑準備
1． GACU POOL：取100mM ATP、CTP、GTP各2.78μl、100mM UTP 0.06μl，加DEPC H2O至100μl。
2. 雜交緩沖液 IPES 0.134g、0.5M EDTA（pH8.0）20μl、5M NaCl 0.8ml、甲酰胺8ml，加DEPC H2O至10ml。
3. RNase消化液：5M NaCl 120μl、1M Tris-HCl(pH7.4) 20μl、0.5M EDTA（pH8.0）20μl、RNase A(10mg/ml) 8μl、RNase T1(250U/μl) 1μl，加DEPC H2O至2ml
二、操作步驟