常見問題 | 可能原因 | 建議解決方案 |
少量或沒有RT-PCR產物 | RNA被降解 | 分離無污染，高質量的RNA；提取RNA的材料要盡量新鮮，防止RNA降解；RT反應前，在變性膠上分析RNA的完整性；RNA提取后，應儲存在100％甲酰胺中， 如果使用RNase抑制劑，加熱時小于45℃；pH小于8.0，否則抑制劑會釋放所有結合的RNase。而且， 在≥0.8mM DTT時加入RNase抑制劑，一定要存在DTT。 |
逆轉錄抑制劑包括： SDS，EDTA，甘油，焦磷酸鈉，亞精胺，甲酰胺和胍鹽等；將對照RNA和樣品混合，與對照RNA反應比較產量，以檢驗是否有抑制劑；通過70％乙醇對RNA沉淀進行清洗，除去抑制劑。 | ||
確定退火溫度適合實驗中所用的引物，對于隨機六聚體，建議在反應溫度保溫之前先在25℃保溫10分鐘；對于基因特異性引物（GSP），可以試一下其他GSP，或換用oligo(dT)或隨機六聚體確定GSP是反義序列。 | ||
增加RNA的量。對于小于50ng的RNA樣品， 可以在第一鏈cDNA合成中使用0.1μg－0.5μg乙酰BSA。 | ||
嘗試其他組織 | ||
對兩步法RT-PCR，在PCR步驟中的cDNA模板不能超過反應體積的1/5 | ||
產物有非特異性條帶 | 引物和模板的非特異性退火 | 避免引物3'端含有2－3個dG或dC；在第一鏈合成中使用基因特異性引物，而不是隨機引物或oligo(dT)；在開始幾個循環使用較高的退火溫度，然后使用較低的退火溫度；使用熱啟動Taq DNA酶進行PCR，提高反應的特異性。 |
遵循用于擴增引物設計的同樣原則 | ||
使用擴增級DNaseⅠ處理RNA；設置沒有逆轉錄的對照反應檢測DNA污染。 | ||
設計在3'端沒有互補序列的引物。 | ||
對于每一個模板和引物組合優化鎂離子濃度。 | ||
使用抗氣霧劑的 吸頭和UDG酶 | ||
產生彌散（smear）條帶 | 第一鏈產物的含量過高 | 常規PCR反應步驟中減少第一鏈產物的量 |
PCR反應中引物過多 | 減少引物的用量 | |
循環數過多 | 優化PCR反應條件，減少PCR的循環次數 | |
退火溫度過低 | 提高退火溫度，防止非特異性的起始及延伸 | |
Dnase降解DNA是產生的寡 核苷酸片段產生的非特異性擴增 | 提取高質量RNA，防止被DNA污染 |