RT-PCR反應受多個因素影響，如硫酸鎂的濃度, 引物退火的溫度，擴增的循環數等。
1、建議選擇0.5-3.0 mM (相差0.5 mM)的硫酸鎂作初步實驗。
2、對于具有較高Tm的引物，增加退火和延伸時的溫度對反應有利。較高的溫度有利于減少非特異的引物結合，因而提高特異產物的得率。
3、大多數目標RNA經40輪PCR反應就能觀察到。但如果目標RNA太稀少，或者只有很少的起始材料，有必要增加擴增的次數到45-50次。
