RT-PCR可以用一步法或兩步法的形式進行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在最佳條件下進行。cDNA的合成首先在反轉錄
RT-PCR可以用一步法或兩步法的形式進行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在最佳條件下進行。cDNA的合成首先在反轉錄緩沖液中進行，然后取出1/10的反應產物進行PCR。在一步法RT-PCR中，在同時為反轉錄和PCR優化的條件下，反轉錄和PCR順次進行。
兩種方法
1、反轉錄酶的選擇1、Money 鼠白血病病毒反轉錄酶
有較強的聚合酶活性，RNA酶H活性相對較弱。最適作用溫度為37°。
2、AMV反轉錄酶
有強的聚合酶活性和RNA酶H活性。最適溫度為42°。
2、合成cDNA引物的選擇
一步法
用于反轉錄的引物可視實驗的具體情況選擇隨機引物、Oligo dT 及基因特異性引物中的一種。對于短的不具有發卡結構的真核細胞mRNA，三種都可。RT-PCR引物的選擇：
1. 隨機引物 適用于長的或具有發卡結構的RNA。適用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反轉錄反應。主要用于單一模板的RT-PCR反應。
兩步法
2. Oligo dT 適用于具有PolyA尾巴的RNA。（原核生物的RNA、真核生物的rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。）由于Oligo dT要結合到PolyA 尾巴上，所以對RNA樣品的質量要求較高，即使有少量降解也 會使全長cDNA合成量大大減少。
3. 基因特異性引物 與模板序列互補的引物，適用于目的序列已知的情況。