總RNA提取
1. 取200mg組織,放到1.5ml EP管中,加入1ml Trizol剪碎。
2. 震蕩30s。
3. 加0.2ml氯仿,劇烈搖動30s,室溫3min。
4. 12000×g,4℃ 離心,15min。
5. 吸上層無色水相,移入另一EP管中(約0.5ml)。
6. 加等體積異丙醇,-20℃,30min。
7. 12000×g,4℃ 離心,10min。在管底部可見微量RNA沉淀
8. 棄上清,加75%乙醇1ml,振蕩。
9. 7500×g,4℃ 離心,10min。
10. 棄上清,用濾紙小心吸取殘留液體,室溫干燥5-10min。
11. 沉淀溶于20μl DEPC水,取1μl加入79μl DEPC水測OD260/OD280
12. 計算濃度與純度,-70℃保存。
逆轉錄合成 cDNA
反應體系如下
混勻快速離心一次
反應條件如下
-20℃ 冰箱凍存
PCR反應
混勻快速離心一次
PCR產物-20℃冰箱保存
取PCR產物8μl 加5×Loading Buffer 2μl 2%瓊脂糖凝膠電泳120V
100mA 30min 溴化乙錠染色,凝膠成象儀成象并保存結