RainDrop數字PCR系統實現10重PCR分析

　　【摘要】美國RainDance Technologies公司擁有ZL的RainStorm即皮升級微流體液滴制備技術，基于此核心技術RainDance推出了新型RainDrop 數字PCR系統，這一新型系統除具有超高檢測靈敏度和精確絕對定量能力外，更擁有無與倫比的多重分析能力，可實現10重PCR分析。

　　數字PCR是一種核酸檢測和絕對定量的新方法。同傳統PCR以及qPCR相比，數字PCR增加了一步分液(partitioning)的操作，將幾十微升的反應體系分隔成了眾多微小的、獨立的反應體系。核酸模板在這種分液的過程中被充分稀釋，理想狀態下每一個小反應體系中至多含有1個分子的核酸模板。對于RainDrop數字PCR來說，基于其ZL的RainStorm技術，RainDrop系統能夠將50微升PCR反應體系快速、均一地制備成1000萬個皮升大小的油包水液滴，確保了真正的單分子擴增。分液完成后，收集所有液滴進行常規的PCR擴增。和qPCR不同，數字PCR不對擴增過程進行實時監測，而是檢測end-point的熒光信號。擴增完成后所有液滴的熒光將逐個被識別并進行計數，不需要構建標準曲線，就可以得到絕對定量的結果。

　　目前在基因組學和遺傳學領域，對高通量同步分析多個目標的需求不斷提升，同時在醫藥相關的如診斷領域，也需要更高效的利用有限量的樣品，因而在同一反應體系中進行多重反應和定量多種目的片段，是PCR技術發展的主導方向。現有的qPCR系統大多可支持同步檢測4種熒光素，然而由于多重引物和探針的組合對PCR反應動力學的影響，現實中多重分析通常難以實現，或需要進行復雜的條件優化。

　　RainDrop數字PCR具有VIC和FAM雙通道熒光信號檢測系統，其熒光信號的獲得是基于Taqman探針原理，通過調整此兩種熒光素探針的使用可以輕松地實現多重分析。基本原理如下示意圖（左）：針對多個目的片段分別使用VIC標記、FAM標記或混合兩種熒光素標記的探針，檢測時帶VIC熒光、FAM熒光或同時帶兩種熒光的液滴將被相應辨識出來，分別被計數。基于此原理，在保證熒光信號強度與探針濃度成正比的前提下，調整熒光素的濃度以及調整兩種熒光素混合時的配比，可以在一個反應中達到多至10重的分析（右圖）。

　　一篇發表在Lab Chip上的文章中，RainDance公司和法國斯特拉斯堡大學的研究人員合作，實踐了應用RainDrop系統進行多重分析。文章作者在對脊髓性肌肉萎縮癥（spinal muscular atrophy）研究中，利用一個5重反應實現了對導致此病癥的幾個重要因素的同步檢測，其中包括了檢測基因缺失（SMN1）、基因拷貝數變化(SMN2)，以及關鍵基因上可能的點突變(SMN1 c.815A>G) (結果見下圖)。

　　這一應用實例充分顯示了RainDrop系統進行多重分析的潛力，5重分析已經突破了當前qPCR技術和其他數字PCR系統的極限。目前數字PCR還存在一些高通量限制，一個反應中的多重分析不僅確保了數據信息的完整性，無疑也大大提高了通量、降低了成本。

　　引用文章出自：Lab Chip, 2011, 11, 2167