對于確定的固定相，混合物樣品中不同的化合物在層析板上爬升的速度不同，這是由于它們對于固定相的吸附能力不同，對于洗脫劑的溶解能力也不同。改變不同的洗脫溶劑，或用不同溶劑配成混合洗脫劑，化合物的分離效果可自行調節。組分在板上的分離情況一般用比移值（Rf）的大小來表征。薄層色譜板上的分離情況還可用于預測柱色譜或快速柱色譜的分離效果。
由于薄層色譜中很難產生均勻的吸附劑涂層，且薄板的質量與吸潮程度亦參差不齊，所以即便是同一物質在同類型而不同的層析板上得到的比移值也難以完全一致。相比于紙色譜這是薄層色譜的缺點。操作中常常將標準試樣與試樣在同一薄板上同時展開并點上混合點，以克服這一缺點。
化合物的分離是利用化合物與流動相之間在固定相上競爭結合位所造成的。例如：使用硅膠做為固定相的話，此固定相可以被視為極性。此時加入兩不同極性的化合物，極性較強的化合物與硅膠間會有較強作用力，因此，更能抵抗流動相并與硅膠結合；極性較弱的化合物與硅膠的作用能力較差，因此更容易流動，擁有更高的Rf値。如果流動相的極性變得更強的話，這樣更能夠抵抗化合物與膠上結合的能力，使所有TLC片上的化合物上升到更高的位置。這樣的溶劑我們稱為"強"溶劑(洗脫劑)，而"弱"洗脫劑則幾乎不能移動它們。"強"與"弱"的比較是取決于TLC片上的涂層(固定相)。