實驗概要
雖然體細胞克隆技術已經在不同物種的基因重編程基礎研究中廣泛應用，但是近十年來利用該技術成功制備胚胎的效率特別低。特別是在小鼠上，可克隆的小鼠系主要限于仔一代，如B6D2F1。最近，我們將TSA引進克隆技術中，使B6D2F1 小鼠卵丘細胞為供體細胞的核移植胚胎成功制備率提高了2-5倍。為了進一步驗證TSA克隆技術的有效性，我們設計試驗：利用TSA處理制備遠交系ICR成鼠。
實驗步驟
1. 供體細胞與受體卵母細胞的收集
常規超排雌鼠(eCG 5IU，48h后hCG 5IU)獲得卵丘卵母細胞。注射hCG后，13-15h從小鼠輸卵管中沖出卵丘卵母細胞，放在0.1%透明質酸酶的Hepes-CZB中37℃ 10min。取ICR雄鼠尾尖，將尾部皮膚取下剪碎，放在35mm培養皿中加5ml 10%胎牛血清的DMEM培養液。10-14d，待細胞長滿培養皿時，將細胞傳代。
2. TSA處理核移植后的胚胎并制備克隆后代
利用成鼠卵丘細胞或尾尖細胞作為核供體。利用Piezo裝置，以ICR小鼠的卵丘細胞或尾尖細胞作為供體細胞，以B6D2F1小鼠卵母細胞作為受體細胞，制備核移植胚胎。所述利用TSA處理重構胚。用10mM SrCl2、5μg/ml CB、5或50 nM TSA的無Ca2 CZB培養重構胚6h，后用含上述同樣濃度TSA的KSOM培養液培養4h。然后用不含TSA的KSOM培養液培養到2-細胞階段，最后移入ICR假孕母鼠體內。所有代孕母鼠在見栓后19.5d 安樂死，所有克隆幼鼠用ICR母鼠代哺乳。