一、材料
1. 緩沖液和溶液
(1) 堿裂解液Ⅰ
50 mmol/L 葡萄糖；25 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0）；10 mmol/L EDTA（pH 8.0）。
溶液Ⅰ一次可配制 100 ml，在 15 psi（1.05 kg/cm2）壓力下蒸汽滅菌 15 min，保存于 4℃。
若欲用柱層析進一步純化所制備的質粒 DNA，無菌的堿裂解液Ⅰ在使用前可補充以適當體積的去 DNA 酶的 RNA 酶 A（胰 RNA 酶）（20 mg/ml），使之終濃度為 100 μg/ml，若欲用其他的方法純化 DNA，則不推薦在此步驟添加 RNA 酶。
(2) 堿裂解液Ⅱ
0.2 N NaOH（從 10 N 貯存液中現用現稀釋）；1%（m/V）SDS。
溶液Ⅱ要現用現配，室溫下使用。
(3) 堿裂解液Ⅲ
5 mol/L 乙酸鉀 60.0 ml；冰乙酸 11.5 ml；H2O 28.5 ml。
所配成的溶液中鉀的濃度為 3 mol/L，乙酸根的濃度為 5 mol/L。保存于 4℃，用時置于冰浴中。
(4) 用于篩選質粒的抗菌素
(5) 乙醇
(6) 異丙烷
(7) 酚：氯仿（1:1，V/V )
(8) STE
(9) TE（pH 8.0）含 20 μg/ml RNase A
2. 培養基
LB、YT 或 Terrific 培養液
3. 離心機和轉頭
Sorvall SS-34 轉頭或與之相當的轉頭。
二、方法
1. 細胞的制備
(1) 挑取轉化后的單菌落，接種到 10 ml 含有適當抗生素的豐富培養基（LB、YT 或 Terrific 培養液）中，于 37℃ 劇烈振搖下培養過夜。
為確保培養物通氣良好：試管的體積應該至少比細菌培養物的體積大 4 倍；試管蓋不宜蓋得太緊；宜在劇烈振搖下溫育。
(2) 將培養物轉移到一個 15 ml 的試管中，于 4℃ 以 2000 g（用Sorvall SS-34 轉頭，4000 r/min）離心 10 min 后收集細菌。
(3) 用輕緩抽吸的方法，盡可能吸干培養液。
除去上清的簡便方法是用一次性使用吸頭或巴斯德吸管與一個真空管道和一個側臂燒瓶相連。輕微抽吸，并使吸頭接觸液面。當液體從管中吸出時，盡可能使吸頭遠離細菌沉淀，以盡量避免沉淀被吸到側臂燒瓶中去。也可用吸管（或巴斯德吸管）和吸球除去培養液，并用吸頭除去管壁上附著的液滴。
未從細菌沉淀中除去所有培養液的后果是質粒不能被限制酶切期或不能完全切割。這是因為培養液中的細胞壁成分抑制多種限制酶的活性。這個問題可這樣解決：用冰預冷的 STE（菌液體積的 0.25 倍）重懸細菌沉淀并離心。
2. 細胞的裂解
(1) 將細菌沉淀重懸于 200 μl 用冰預冷的溶液Ⅰ中，劇烈振蕩，將懸浮液轉移到微量離心管中。
為確保細菌沉淀在堿裂解液Ⅰ中完全分散，將兩個微量離心管的管底互相接觸同時振蕩，以提高細菌沉淀分散的速度和效率。
原方案（Birnboitn and Doly 1979 ) 要求在這一步用溶菌酶消化細菌細胞壁，如果待處理細菌培養物的體積少于 10 ml 時，這一步驟可以省略。
(2) 加 400 μl 新配制的溶液Ⅱ到每管細菌懸液中，蓋緊管口，快速顛倒離心管 5 次，以混合內容物。切勿渦旋振蕩！將離心管置于冰上。
應確保離心管的整個內壁均與堿裂液Ⅱ接觸。
(3) 加 300 μl 冰預冷的堿裂解液Ⅲ，蓋緊管口，反復顛倒數次，使之在黏稠的細菌裂解物中分散均勻，然后將離心管置于冰上 3~5 min。
(4) 用微量離心機于 4℃ 以最大轉速離心 5 min，轉移 600 μl 上清到一只潔凈離心管中。
(5) 加等體積的酚：氯仿，通過劇烈振蕩混合有機相和水相，然后用微量離心機于 4℃ 以最大轉速離心 2 min，轉移上層水相到另一離心管中。
3. 質粒 DNA 的回收
(1) 在室溫下加 600 μl 異丙醇以從上清中沉淀核酸，劇烈振蕩混合溶液，于室溫下放置 2 min。
(2) 用微量離心機在室溫下以最大轉速離心 5 min，收集核酸沉淀。
(3) 按上述步驟 3 所述小心吸去上清液，將離心管倒置于紙巾上，使所有液體流干，再將吸附于管壁上的液滴除盡。
(4) 加 1 ml 70% 乙醇于沉淀中并將蓋緊的試管顛倒數次，用微量離心機在室溫下以最大轉速離心 2 min，回收 DNA。
(5) 再次用輕微抽吸的方法（步驟 3 ) 除去上清。
這一步驟要格外小心，因為沉淀有時貼壁不牢。
(6) 除去管壁上的酒精液滴，將開口的試管置于室溫直到酒精揮發并在管內沒有可見的液體存在（2~5 min)。
如果用干燥器或真空干燥的方法干燥 DNA 沉淀，在某些情況下它會變得難以溶解并且可能變性（Svaren et al. 1987)。將沉淀在室溫下干燥 10~15 min 對于乙醇揮發來說足夠了，而且不會引起 DNA 脫水。
(7) 用 100 μl 含有去 DNA 酶的 RNase A（胰 RNA 酶）（20 μg/ml）的 TE 重新溶解核酸，溫和振蕩幾秒鐘，貯存于 -20℃。 | 
